• 4-AP
• chloride sensor
• epilepsy
• fluorescence
• iClima

La regolazione del cloruro intracellulare e del pH è un determinante cruciale dell'eccitabilità neuronale, influenzando sia le condizioni fisiologiche che patologiche. Strumenti di misurazione precisi sono essenziali per chiarire l'interazione complessa tra il cloruro intracellulare e la funzione neuronale. Questa tesi presenta la caratterizzazione di un nuovo sensore ratiometrico geneticamente codificato, progettato per monitorare le dinamiche del cloruro con elevata precisione. Utilizzando l'imaging a due fotoni in-vivo su topi anestetizzati, abbiamo dimostrato l'efficacia del sensore nel catturare i cambiamenti in tempo reale della concentrazione di cloruro nella corteccia visiva primaria, registrando contemporaneamente l'attività elettrica di rete. Abbiamo indagato le dinamiche temporali della concentrazione di cloruro durante l'inizio e la fine delle crisi epilettiche, rivelando come i livelli di cloruro cambino in risposta a questi eventi. Inoltre, abbiamo esaminato se un farmaco pro-epilettogeno potesse indurre fluttuazioni sottili nei livelli di cloruro intracellulare o se un'intensa attività elettrica potesse portare a cambiamenti più sostenuti nelle concentrazioni basali di cloruro. Il nostro studio evidenzia la capacità del sensore di fornire letture fluorescenti stabili, riducendo al minimo l'interferenza delle variazioni del pH. Questi risultati sottolineano il potenziale del sensore nel rilevare cambiamenti sfumati nelle concentrazioni di cloruro, migliorando la nostra comprensione del suo ruolo nell'eccitabilità neuronale e nelle dinamiche delle crisi epilettiche.

The regulation of intracellular chloride and pH is a crucial determinant of neuronal excitability, influencing both physiological and pathological conditions. Precise measurement tools are essential to elucidate the complex interplay between intracellular chloride and neuronal function. This thesis presents the characterization of a novel genetically encoded ratiometric sensor designed to monitor chloride dynamics with high accuracy. Using in-vivo two-photon imaging on anesthetized mice, we demonstrated the sensor's effectiveness in capturing real-time changes in chloride concentration in the primary visual cortex while simultaneously recording network electrical activity. We investigated the temporal dynamics of chloride concentration during the initiation and termination of epileptic seizures, revealing how chloride levels change in response to these events. Additionally, we examined whether a pro-epileptogenic drug could induce subtle fluctuations in intracellular chloride levels or if intense electrical activity could lead to more sustained changes in baseline chloride concentrations. Our study highlights the sensor's ability to provide stable fluorescence readings, minimizing the interference of pH variations. These findings underscore the sensor's potential to detect nuanced shifts in chloride concentrations, advancing our understanding of its role in neuronal excitability and seizure dynamics.