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Tesi etd-09262012-102748


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
AMATO, CLELIA
URN
etd-09262012-102748
Title
"Studio dei meccanismi responsabili della de-regolazione dell'espressione genica in pazienti affetti da Sindrome di Cornelia de Lange mediante un approccio 'genome wide'"
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Dott. Musio, Antonio
correlatore Prof. Deri, Paolo
correlatore Prof.ssa Sbrana, Isabella
Parole chiave
  • Chromatin ImmunoPrecipitation.
  • De-regolazione dell'espressione genica
  • Coesina
  • Sindrome di Cornelia de Lange
Data inizio appello
18/10/2012;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
18/10/2052
Riassunto analitico
La sindrome di Cornelia de Lange (CdLS) è una condizione patologica che colpisce un neonato ogni diecimila. I soggetti affetti presentano tratti somatici tipicamente dismorfici e anomalie agli arti, in particolare quelli superiori; manifestano inoltre ritardo nello sviluppo e un deficit mentale più o meno marcato. Ad oggi sono stati identificati tre geni responsabili della CdLS: NIPBL, SMC1A ed SMC3. Mutazioni in NIPBL sono state identificate in circa il 60% dei casi, in SMC1A in circa il 5% mentre un solo probando porta la mutazione in SMC3. I geni citati codificano per proteine che fanno parte del complesso proteico della coesina o per fattori regolatori della coesina stessa. Infatti, il core della coesina è costituito da due proteine Structural Mainteinance of Chromosome (SMC, SMC1A ed SMC3) e due proteine non SMC, RAD21 e SA1/SA2. La proteina NIPBL invece è richiesta per il caricamento della coesina sulla cromatina. Il ruolo canonico della coesina è quello di presiedere alla corretta coesione tra i cromatidi fratelli, e pertanto si è ritenuto inizialmente che alla base della CdLS ci fossero dei difetti di coesione dei cromatidi fratelli. Tuttavia l&#39;analisi di metafasi di soggetti affetti non mostra alcuna anomalia. <br>Negli ultimi anni, numerose evidenze sperimentali suggeriscono che la coesina è in grado di svolgere anche un ruolo importante nella regolazione dell&#39;espressione genica. Sembra infatti che la coesina possa svolgere la funzione di “isolatore” ostacolando l’interazione fisica tra il promotore e l’enhancer, impedendo così la formazione dell&#39;apparato trascrizionale e l’avvio della trascrizione. Questo modello prevede che, per una corretta attività trascrizionale, la coesina venga rimossa o dislocata dalla cromatina, in modo che il loop originatosi consenta la giustapposizione di promotore ed enhancer. A supporto di tale modello vi sono alcuni dati sperimentali. Mutazioni nei geni della coesina conferiscono al complesso una maggiore affinità di legame al DNA rispetto alle proteine wild type, e pazienti CdLS mostrano un profilo di espressione genica alterato.<br>Scopo di questa tesi è di investigare se mutazioni nei geni della coesina influenzano l’accessibilità della RNA polimerasi II (RNA pol II) alle regioni regolatorie. Esperimenti di sequenziamento della cromatina immunoprecipitata (ChIP-seq) eseguiti, attraverso una collaborazione scientifica, presso il laboratorio di Richard Young (Massachusetts Institute of Technology, Boston) hanno permesso di identificare sia le regioni del genoma in cui la coesina e i suoi regolatori vengono caricate co-localizzandosi con la RNA pol II, sia quelle in cui la coesina non si lega. Correlando questi dati con quelli pubblicati derivanti dall&#39;utilizzo di microarray di espressione in cellule CdLS, sono state selezionate cinque categorie di regioni: 1) contenenti geni housekeeping, 2) contenenti geni cellula-specifici, 3) contenenti geni in cui l&#39;arricchimento della coesina è maggiore, 4) regioni contenenti geni non legati dalla coesina, 5) regioni di deserto genico. Linee linfoblastoidi di pazienti CdLS e di soggetti sani, usate come controllo, sono state sottoposte ad immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) al fine di ottenere un arricchimento in sequenze legate dalla RNA pol II, e sono state successivamente analizzate per le categorie di regioni precedentemente descritte tramite Real Time PCR.<br>I risultati ottenuti mostrano una riduzione del reclutamento della RNA pol II alle regioni occupate dalla coesina nelle linee CdLS rispetto a quelle di controllo, portando nuove evidenze sperimentali a supporto dell&#39;ipotesi che alla base della CdLS vi sia una de-regolazione della trascrizione genica.
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