Tesi etd-06242026-145356 |
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Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
URN
etd-06242026-145356
Titolo
Development of an Automated Bottom-Up Proteomics Workflow and Its Application to Drug Resistance Profiling in B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia
Dipartimento
CHIMICA E CHIMICA INDUSTRIALE
Corso di studi
CHIMICA
Relatori
.
relatore Prof.ssa Bonaduce, Ilaria
relatore Dott. McDonnell, Liam A.
controrelatore Prof. Lomonaco, Tommaso
relatore Dott. McDonnell, Liam A.
controrelatore Prof. Lomonaco, Tommaso
Parole chiave
- Agilent AssayMAP Bravo
- automated sample preparation
- automazione
- B-cell acute lymphoblastic leukemia
- biomarker
- bottom-up proteomics
- chemoresistance
- Data Independent Acquisition
- farmacoresistenza
- mass spectrometry (MS)
- nano LC
- optimization
- ottimizzazione
- pathways
- proteomica
- tandem mass spectrometry
- untargeted proteomics
Data inizio appello
16/07/2026
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
16/07/2096
Riassunto (Inglese)
Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomics is essential for biological research, yet manual sample preparation remains a major bottleneck due to high technical variability, risk of human errors and low throughput. This project developed and validated a fully automated analytical workflow using the Agilent AssayMAP Bravo robotic platform.
The optimization phase established a urea-based lysis and digestion protocol, evaluating variables such as sonication methods, protein concentrations, and enzyme ratios. This method was then transferred to the AssayMAP Bravo system, to provide automated reduction, alkylation, digestion, and peptide desalting with C18 cartridges.
The workflow was then applied to investigate chemoresistance in B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Four genetically distinct cell lines (RS4;11, KOPN-8, HAL-01, REH) were investigated, including their chemo-sensitive parental cells, and chemo-resistant clones made resistant to the chemotherapy drugs Doxorubicin and Vincristine. In total 60 samples were simultaneously prepared for quantitative proteomics. Advanced nLC-MS/MS and bioinformatics allowed for the mapping of biochemical pathways underlying drug resistance. This work establishes a robust, standardized blueprint for automating complex analytical processes in pre-clinical cancer research.
The optimization phase established a urea-based lysis and digestion protocol, evaluating variables such as sonication methods, protein concentrations, and enzyme ratios. This method was then transferred to the AssayMAP Bravo system, to provide automated reduction, alkylation, digestion, and peptide desalting with C18 cartridges.
The workflow was then applied to investigate chemoresistance in B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Four genetically distinct cell lines (RS4;11, KOPN-8, HAL-01, REH) were investigated, including their chemo-sensitive parental cells, and chemo-resistant clones made resistant to the chemotherapy drugs Doxorubicin and Vincristine. In total 60 samples were simultaneously prepared for quantitative proteomics. Advanced nLC-MS/MS and bioinformatics allowed for the mapping of biochemical pathways underlying drug resistance. This work establishes a robust, standardized blueprint for automating complex analytical processes in pre-clinical cancer research.
Riassunto (Italiano)
La proteomica bottom-up basata sulla spettrometria di massa (MS) è fondamentale per la ricerca biologica, ma la preparazione manuale dei campioni rimane un importante limite a causa dell'elevata variabilità tecnica, del rischio di errori umani e della bassa produttività. Questo progetto ha sviluppato e validato un workflow analitico completamente automatizzato utilizzando la piattaforma robotica Agilent AssayMAP Bravo.
La fase di ottimizzazione ha stabilito un protocollo di lisi e digestione basato su urea, valutando i metodi di sonicazione, le concentrazioni proteiche e i rapporti enzimatici. Questo metodo è stato poi trasferito al sistema AssayMAP Bravo per automatizzare le fasi di riduzione, alchilazione, digestione e desalting dei peptidi con cartucce C18.
Il workflow è stato successivamente applicato per studiare la chemioresistenza nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B. Sono state esaminate quattro linee cellulari geneticamente distinte (RS4;11, KOPN-8, HAL-01, REH), nelle loro forme chemio-sensibili e i cloni chemio-resistenti, resi tali ai farmaci chemioterapici Doxorubicina e Vincristina. In totale, 60 campioni sono stati preparati simultaneamente per la proteomica quantitativa. Tecniche avanzate di nLC-MS/MS e bioinformatica hanno permesso di mappare le vie biochimiche alla base della resistenza ai farmaci. Questo lavoro stabilisce un modello robusto e standardizzato per automatizzare processi analitici complessi nella ricerca oncologica pre-clinica
La fase di ottimizzazione ha stabilito un protocollo di lisi e digestione basato su urea, valutando i metodi di sonicazione, le concentrazioni proteiche e i rapporti enzimatici. Questo metodo è stato poi trasferito al sistema AssayMAP Bravo per automatizzare le fasi di riduzione, alchilazione, digestione e desalting dei peptidi con cartucce C18.
Il workflow è stato successivamente applicato per studiare la chemioresistenza nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B. Sono state esaminate quattro linee cellulari geneticamente distinte (RS4;11, KOPN-8, HAL-01, REH), nelle loro forme chemio-sensibili e i cloni chemio-resistenti, resi tali ai farmaci chemioterapici Doxorubicina e Vincristina. In totale, 60 campioni sono stati preparati simultaneamente per la proteomica quantitativa. Tecniche avanzate di nLC-MS/MS e bioinformatica hanno permesso di mappare le vie biochimiche alla base della resistenza ai farmaci. Questo lavoro stabilisce un modello robusto e standardizzato per automatizzare processi analitici complessi nella ricerca oncologica pre-clinica
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Tesi non consultabile. |
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