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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-06192017-091654


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
ANDREUCCI, ALESSANDRO
URN
etd-06192017-091654
Titolo
5'-Nucleotidasi citosolica cN-II: effetti del silenziamento sul metabolismo e la proliferazione cellulare
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof.ssa Tozzi, Maria Grazia
correlatore Dott.ssa Pesi, Rossana
Parole chiave
  • A549; proliferazione cellulare; CNII
Data inizio appello
17/07/2017;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
17/07/2020
Riassunto analitico
La cN-II (5’-nucleotidasi citosolica di tipo II) è una proteina citosolica, descritta da diversi gruppi di ricerca a partire dal 1967. CN-II è una proteina appartenente alla famiglia delle 5’-nucleotidasi, una famiglia di fosfoesterasi con differente localizzazione, specificità di substrato e regolazione. Questa famiglia comprende otto diversi membri, una proteina ectosolica ancorata alla membrana, sei a localizzazione citosolica e una a livello della matrice mitocondriale. La cN-II è uno degli isoenzimi citosolici; è stato isolato da diversi organismi mostrando una distribuzione ubiquitaria, una particolare conformazione strutturale e una intricata regolazione allosterica. CN-II può essere considerato un enzima bifunzionale per la capacità di catalizzare il trasferimento di un gruppo fosfato da un nucleotide donatore a un nucleoside accettore passando attraverso la formazione di un intermedio covalente enzima-fosfato. Il gruppo fosfato legato al sito attivo dell’enzima può essere idrolizzato da una molecola d’acqua oltre che avere la possibilità di essere ceduto a un nucleoside accettore. La cN-II è attiva nei confronti dei nucleosidi 6- idrossipurinici 5’-monofosfato (IMP, dIMP, GMP, dGMP, XMP) e può trasferire il fosfato quasi esclusivamente a inosina o deossinosina. Il ruolo fisiologico dell’enzima è quello di contribuire all’omeostasi della concentrazione di IMP e di tutti i composti purinici da esso derivanti. Il meccanismo catalitico così come la struttura dell’enzima sono caratteristici della superfamiglia delle aloacido dealogenasi a cui l’enzima appartiene. La regolazione enzimatica è complessa e dipende dalla carica energetica della cellula. ATP, ADP, BPG (2,3-bifosfoglicerato), Ap4A (diadenosinatetrafosfato), polifosfati e alte concentrazioni di KCl attivano l’enzima, mentre il fosfato è l’unico inibitore noto; l’enzima necessita inoltre come cofattore Mg2+ e ha la massima attività in ambiente riducente. L’espressione di tale enzima è elevata in tessuti e organi con un elevato turnover cellulare come nel caso delle cellule tumorali. La cN-II è attiva anche nei confronti di analoghi di nucleosidi e nucleotidi utilizzati nelle terapie antitumorali e antivirali, quali ad esempio 2’,3’-dideossiinosina, acyclovir, ribavirina, fludarabina: una piena comprensione della struttura di questo enzima potrà contribuire alla buona riuscita di terapie su di esse basate. Alterazioni dell’attività della cN-II sono state evidenziate in pazienti affetti dalla sindrome di Lesh-Nyan, un grave disturbo neurologico e comportamentale, mentre è controverso il ruolo dell’enzima nelle neoplasie ematologiche. Diversi autori mostrano come elevati livelli di mRNA della cN-II in pazienti adulti affetti da leucemia mieloide acuta e trattati con citarabina, siano un marker statisticamente significativo di un peggior successo terapeutico. Considerando che la citarabina monofosfato non è substrato dell’enzima, è stato ipotizzato che il livello del mRNA della cN-II rifletta lo stato proliferativo delle cellule e sia quindi un marker di una forma più severa della patologia. In base alle caratteristiche cinetiche dell’enzima si ritiene che il ruolo della cN-II sia l’idrolisi dell’eccesso di IMP in condizioni di elevata carica energetica cellulare. In condizioni ischemiche l’attività dell’enzima decresce, prevenendo la perdita dei nucleotidi purinici. Lo scopo della mia tesi è quello di mettere in evidenza gli effetti dell’espressione della cN-II sulla proliferazione cellulare, in quanto è stato già osservato in precedenza che una variazione dei livelli di espressione dell’enzima si riflette sulle capacità proliferative. Per il mio studio ho utilizzato una linea cellulare di adenocarcinoma dell'epitelio alveolare umano denominata A549. Ho utilizzato due tipi cellulari, cellule controllo ingegnerizzate con un plasmide vuoto e cellule ingegnerizzate con un plasmide in cui è inserito uno short-haerpin per silenziare parzialmente il gene che codifica per la cN-II. Con la tecnica del dosaggio radioenzimatico ho analizzato l'attività fosfotransferasica della proteina e la percentuale del suo silenziamento nelle cellule A549. I due tipi cellulari sono stati coltivati sia in assenza che in presenza di 2-deossiglucosio (20mM) a differenti concentrazioni e a tempi diversi, al fine di valutare la capacità proliferativa delle cellule e le eventuali alterazioni metabolico-funzionali legate alla diversa espressione della cN-II. Abbiamo quindi valutato sia la crescita cellulare nelle varie condizioni, sia la funzionalità mitocondriale ed il livello di fosforilazione di AMPk, e Akt. I nostri risultati preliminari indicano che l’elevata espressione della cN-II quale si trova nei tumori molto aggressivi è legata ad un fenotipo glicolitico con alta velocità di sintesi proteica, mentre il silenziamento della cN-II determina un fenotipo più ossidativo con aumento della massa e della funzionalità mitocondriali.
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