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La malattia di Alzheimer (Alzheimer disease, da cui l’acronimo AD) è una patologia neurodegenerativa cronica e progressivamente invalidante. È oggi la più diffusa forma di demenza, rappresentando dal 50 al 75% dei casi totali, che ammontano a circa 55 milioni nella popolazione mondiale, un numero destinato ad aumentare dato il crescente invecchiamento demografico e l’allungarsi dell’aspettativa di vita. L’età è infatti il maggior fattore di rischio: l’incidenza arriva al 10% fra i soggetti sopra i 65 anni, mentre fra la popolazione che supera gli 85 raggiunge il 50%. La sintomatologia è tipicamente legata al declino cognitivo e alla perdita di memoria, ma può anche coinvolgere la sfera legata al linguaggio e all’umore. Ad oggi, una terapia definitiva e risolutiva per AD non esiste; l’identificazione di target terapeutici e lo sviluppo di nuovi farmaci per questa malattia sono ancora una urgente necessità.
Dal punto di vista molecolare, l’insorgenza di AD è correlata all’accumulo extracellulare di placche di beta-amiloide (A), aggregati proteici insolubili che ostacolano le connessioni sinaptiche e contribuiscono alla creazione di uno stato infiammatorio e di stress ossidativo che porta progressivamente a morte neuronale. La formazione delle placche è causata dalla proteolisi anomala della proteina precursore dell’amiloide (APP) da parte degli enzimi β-secretasi e γ-secretasi che producono un peptide (A) che tende all’aggregazione prima in oligomeri e successivamente in fibrille e placche. L’accumulo di A può essere determinato da differenti cause, fra le quali la sovraespressione del gene di APP (che porta ad un’aumentata produzione della proteina corrispondente) e/o alcune varianti geniche la cui presenza causa oppure predispone all’ accumulo di A. Fra quest’ ultime, la mutazione svedese di APP (così denominata perché scoperta in una famiglia nella città svedese di Uppsala) comporta nella proteina una doppia sostituzione amminoacidica nella porzione N-terminale: in particolare in posizione 595 una lisina viene sostituita con un’asparagina e in posizione 596 la metionina viene sostituita da una leucina. La mutazione svedese di APP provoca un forte incremento di affinità con l’enzima proteolitico BACE1 che agendo porta alla formazione di A.
Lo scopo di questo progetto di tesi è stato quello di creare un modello cellulare neuronale con un danno indotto dall’ accumulo di A ottenuto sia dalla sovraespressione di APP wild type che dall’inserimento della mutazione svedese di APP.
Si è utilizzata la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y, un tipo di cellule immortalizzate che possono essere differenziate a fenotipo simil neuronale e che, ad oggi, sono ampiamente utilizzate come modello in vitro per lo studio delle patologie neurologiche. Le cellule SH-SY5Y sono state dapprima trasfettate con un plasmide contenente la forma wild type della proteina APP (pCAX- APP wt). Per l’inserimento del DNA plasmidico nell’unità cellulare sono state utilizzate due differenti tecniche di trasfezione: la nucleofezione e la lipofezione, di cui sono state valutate efficienza e tossicità. Inoltre, si è cercato di portare avanti una selezione antibiotica con antibiotico G418 (geneticina opportunamente modificata) finalizzata a selezionare solamente le cellule efficacemente trasfettate con il plasmide di interesse. L’espressione stabile di tale plasmide nella cellula potrà essere verificata mediante analisi western blot dell’aumentata produzione di APP.
Esperimenti futuri permetteranno di avere un quadro più chiaro sul fatto se da tale espressione risulta un accumulo di A e una conseguente tossicità. Nel frattempo, è stato avviato lo sviluppo del costrutto ricombinante per la forma mutante di APP (pCAX-APP swe), a partire dai plasmidi di pCAX- APP wt e pcDNA3.1-APP swe, sui quali sono state effettuate operazioni di clonaggio e trasformazione batterica fino alla preparazione di mini prep che, una volta purificate, sono state sequenziate. Tale costrutto, una volta inserito nelle cellule, potrà favorire la produzione della forma mutata di APP e, di conseguenza, aumentare il danno neurotossico.
L’ottenimento di tali modelli cellulari di neurodegenerazione potrà avere molte applicazioni, tra cui testare l’efficacia in vitro di molecole dalla potenziale attività farmacologia o neuroprotettiva e approfondire lo studio dei processi fisio-patologici alla base della neurodegenerazione nell’AD.