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• NLC5
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Le ceroidolipofuscinosi neuronali (CLN) sono una famiglia di patologie neurodegenerative rare, determinate geneticamente e caratterizzate da un progressivo declino cognitivo, motorio e da retinopatia che può portare a cecità. Sono stati identificati 14 geni e ciascuno di essi è in grado di determinare l’insorgenza di un sottotipo diverso di CLN. Le mutazioni a livello di questi geni comportano l’accumulo a livello lisosomiale di lipofuscina, materiale di scarto auto fluorescente composto da un aggregato di proteine e lipidi. Mutazioni del gene CLN5, che codifica per la bis(monoacilglicerolo)fosfato sintetasi lisosomiale (BMP), sono causa della forma tardo-infantile denominata CLN5. In questo lavoro di tesi gli studi sono stati condotti nel modello zebrafish knock-out (KO) per il gene CLN5, precedentemente generato mediante la tecnica del CRISPR/cas9 e caratterizzato sia da un punto di vista molecolare che fenotipico, dimostrando di replicare le principali caratteristiche patologiche dei pazienti.
L’obiettivo del progetto è stato quello di ricercare possibili nuovi pathway molecolari e biomarcatori che potessero rivelare nuovi target terapeutici e migliorare e potenziare la diagnosi di questa patologia incurabile. Analisi di proteomica sul modello knock-out a diversi stadi di sviluppo ha permesso di identificare una nuova via molecolare alterata associata alla patologia CLN, che è risultato essere il metabolismo del glucosio, inoltre tramite la validazione in vivo è stato confermato un alterato uptake del glucosio in larve mutanti cln5-/- rispetto ai controlli wild-type (WT). Le analisi di proteomica hanno permesso di identificare un nuovo biomarcatore di malattia, la fosfoglicerato deidrogenasi (PHGDH). L’enzima catalizza la reazione di formazione del 3-fosfoglicerato (3-PG) a partire da 3-fosfoidrossipiruvato. La specificità del biomarcatore, individuato in zebrafish, è stata confermata anche mediante analisi molecolare su fibroblasti appartenenti a pazienti che possiedono mutazioni sui geni CLN5 e CLN7. L’individuazione di questo nuovo biomarcatore trans-specie conferma la solidità del nostro modello animale e apre la strada verso la possibilità di testare farmaci già disponibili in commercio, proponendo un approccio di riposizionamento. Per questo motivo stiamo testando, sia su embrioni mutanti cln5-/- sia su fibroblasti di pazienti con mutazione in CLN5, la metformina. E’ un farmaco antidiabetico noto per i suoi effetti sull’uptake del glucosio e per la sua attività pro-autofagica e lipolitica, si suppone che possa ristabilire un equilibrio metabolico permettendo un recupero fenotipico dei difetti locomotori delle larve cln5-/-. Pertanto, la metformina potrebbe trovare una nuova applicazione nelle ceroidolipofuscinosi neuronali e in altre patologie neurodegenerative.








Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL) are a family of rare neurodegenerative diseases, genetically determined, characterized by progressive cognitive and motor decline, along with retinopathy that can lead to blindness. Fourteen genes have been identified, and each of them can lead to the onset of a different subtype of NCL. Mutations in these genes cause the accumulation of lipofuscin, a fluorescent waste material composed of aggregated proteins and lipids, at the lysosomal level. Mutations in the CLN5 gene, which encodes for lysosomal bis(monoacylglycerol)phosphate synthase (BMP), are responsible for the late-infantile form known as CLN5. In this thesis, the studies were conducted on a zebrafish knock-out (KO) model for the CLN5 gene, previously generated using CRISPR/Cas9 technology and characterized both molecularly and phenotypically, demonstrating the replication of the main pathological features of patients.
The goal of the project was to investigate possible new molecular pathways and biomarkers that could reveal new therapeutic targets and enhance the diagnosis of this incurable disease. Proteomic analysis on the knock-out model at different developmental stages allowed the identification of a new altered molecular pathway associated with CLN pathology, which turned out to be glucose metabolism. Additionally, in vivo validation confirmed an altered glucose uptake in cln5-/- mutant larvae compared to wild-type (WT) controls. Proteomic analysis also identified a new disease biomarker, phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH). The enzyme catalyzes the formation of 3-phosphoglycerate (3-PG) from 3-phosphohydroxy-pyruvate. The specificity of this biomarker, identified in zebrafish, was also confirmed through molecular analysis on fibroblasts from patients carrying mutations in CLN5 and CLN7 genes. The identification of this new trans-species biomarker confirms the robustness of our animal model and opens the door to testing already available commercial drugs, proposing a repositioning approach. For this reason, we are testing metformin, an antidiabetic drug known for its effects on glucose uptake and its pro-autophagic and lipolytic activities, both on cln5-/- mutant embryos and on fibroblasts from patients with CLN5 mutations. It is assumed that metformin may restore metabolic balance, allowing for phenotypic recovery of locomotor defects in cln5-/- larvae. Therefore, metformin could find a new application in neuronal ceroid lipofuscinoses and other neurodegenerative diseases.