ETD

• alginate
• alginato
• antibiotic resistance
• antibiotico resistenza
• antivirulence strategies
• bacterial motility
• biofilm
• Chromobacterium violaceum
• Discinesia Ciliare Primaria
• esopolisaccaridi
• exopolysaccharides
• fattori di virulenza
• inibitori del Quorum Sensing
• LasB
• motilità batterica
• piocianina
• piorubina
• pioverdina
• Primary Ciliary Dyskinesia
• Pseudomonas aeruginosa
• pyocyanin
• pyorubin
• pyoverdine
• Quorum Sensing
• Quorum Sensing inhibitors.
• ramnolipidi
• rhamnolipids
• strategie antivirulenza
• violacein
• violaceina
• virulence factors

Riassunto:
La Discinesia Ciliare Primaria (DCP) è una malattia genetica rara, a trasmissione autosomica recessiva, con prevalenza stimata di 1 caso ogni 10.000-20.000 nuovi nati. Essa è causata da una disfunzione delle ciglia vibratili presenti sulle cellule epiteliali delle vie aeree, che compromette un’efficace clearance muco-ciliare, predisponendo a ricorrenti infezioni del tratto respiratorio. In particolare, la specie Pseudomonas aeruginosa è stata associata ad un aumento della frequenza delle esacerbazioni, ad un peggioramento della funzionalità polmonare e, quindi, a una riduzione della qualità della vita nei pazienti con DCP. P. aeruginosa presenta una spiccata tendenza a sviluppare resistenza nei confronti degli antibiotici, al punto che l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha inserito tale batterio nella lista di patogeni per i quali urgono nuovi approcci terapeutici. Negli ultimi anni, molte ricerche si sono concentrate sullo sviluppo di strategie antibatteriche alternative, tra cui l’utilizzo di farmaci antivirulenza. A differenza degli antibiotici convenzionali, che mirano a inibire o uccidere i batteri, i farmaci antivirulenza agiscono bloccando i meccanismi di virulenza specifici del patogeno, riducendo la sua capacità di causare malattia senza influenzarne direttamente la crescita. Questo approccio offre un vantaggio significativo in quanto si ritiene possa ridurre la pressione che porta alla selezione di ceppi resistenti. In questa ottica, precedenti studi, condotti nel medesimo laboratorio dove è stata svolta la presente tesi, hanno dimostrato che nuovi composti, caratterizzati da scaffold di tipo N-benzyloxy-amino acid-hydroxamate (BAHs) sono in grado, a concentrazioni non citotossiche, di ridurre significativamente sia l’attività dell’elastasi LasB, che rappresenta un importante fattore di virulenza di P. aeruginosa, sia la formazione del biofilm. Inoltre, recentemente è stato dimostrato da altri gruppi di ricerca che alcuni derivati idrossamici sono dotati anche di attività anti-Quorum Sensing (QS). Il QS è un meccanismo di comunicazione tra batteri che permette loro di coordinare attività di gruppo basate sulla densità delle cellule. Quando una popolazione batterica raggiunge un numero sufficiente (un "quorum"), le molecole segnale che producono si accumulano fino a una concentrazione critica, attivando risposte fisiologiche coordinate come la formazione di biofilm, la sintesi di fattori di virulenza e la produzione di sostanze che favoriscono la sopravvivenza. Il presente lavoro di tesi si propone di studiare la capacità di alcuni BAHs di inibire il QS, e la sintesi di fattori di virulenza da esso regolati, in ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti con DCP.
A tale scopo, sono stati inizialmente caratterizzati 16 ceppi di P. aeruginosa, isolati dall’espettorato di altrettanti pazienti affetti da DCP e afferenti alla clinica Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. Tali ceppi batterici sono stati caratterizzati sia per proprietà generali (fenotipo mucoide, suscettibilità agli antibiotici, tempo di duplicazione e tolleranza al perossido di idrogeno) che per la capacità di sintetizzare fattori di virulenza regolati direttamente o indirettamente dal QS tra cui: la LasB, una metalloproteasi zinco-dipendente extracellulare; i ramnolipidi, biosurfattanti implicati nella formazione di biofilm; la piocianina, una fenazina con attività citotossica; la pioverdina, un sideroforo; la piorubina, un pigmento ad attività antiossidante; la motilità di tipo swarming ed infine la capacità di formare biofilm. I risultati hanno indicato una marcata variabilità fenotipica tra i ceppi di P. aeruginosa, nella capacità di produrre i fattori di virulenza presi in considerazione. Tali risultati sembrano in parte sovrapponibili con quelli riportatati in letteratura nei pazienti affetti da Fibrosi Cistica, in cui P. aeruginosa, come nel caso della DCP, provoca infezioni croniche difficilmente eradicabili.
In una seconda fase del lavoro sperimentale si è valutato l’effetto dei BAHs sulla sintesi dei fattori di virulenza di P. aeruginosa. Tra tutti i ceppi precedentemente caratterizzati sono stati selezionati i ceppi PaDCP-1, non mucoide, e PaDCP-2, mucoide, entrambi caratterizzati dalla capacità di produrre un’elevata quantità dei fattori di virulenza.
L’attività anti-QS dei BAHs è stata saggiata inizialmente su Chromobacterium violaceum ATCC 12472, un ceppo batterico noto per la produzione di violaceina, un pigmento la cui sintesi è regolata dal QS. I risultati hanno evidenziato un’inibizione superiore al 50% nella sintesi della violaceina, e quindi del QS, da parte dell’inibitore RDL-135, saggiato alle concentrazioni di 200µM, 100µM e 50µM.
Una volta dimostrata l’attività anti-QS, l’RL-135 è stato saggiato per la sua capacità di inibire, sui ceppi clinici PaDCP-1 e PaDCP-2, la produzione di alcuni fattori di virulenza, la cui sintesi è regolata dal QS. I risultati hanno indicato che l’RDL-135 era in grado di ridurre significativamente sia la sintesi di piocianina che dei ramnolipidi a concentrazioni non citotossiche comprese tra 50 e 100µM.
Questi risultati preliminari supportano l’ipotesi che gli inibitori della LasB possano rappresentare un valido approccio anti-virulenza contro P. aeruginosa, sebbene ulteriori studi in modelli in vivo saranno necessari per valutarne meglio potenzialità e limiti.

Abstract:
Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a rare genetic disorder, transmitted as an autosomal recessive trait, with an estimated prevalence of 1 case per 10,000-20,000 newborns. It is caused by a dysfunction of the cilia present on the epithelial cells of the airways, which compromises effective mucociliary clearance, predisposing patients to recurrent respiratory tract infections. In particular, the species Pseudomonas aeruginosa has been associated with an increase in the frequency of exacerbations, a worsening of lung function, and, therefore, a reduction in quality of life in patients with PCD. P. aeruginosa has a marked tendency to develop resistance to antibiotics, and the World Health Organization (WHO) has included this bacterium in the list of pathogens for which new therapeutic approaches are urgently needed. In recent years, much research has focused on the development of alternative antibacterial strategies, including the use of antivirulence drugs.
Unlike conventional antibiotics, which aim to inhibit or kill bacteria, antivirulence drugs work by blocking the pathogen's specific virulence mechanisms, reducing its ability to cause disease without directly affecting its growth. This approach offers a significant advantage as it is believed to reduce the pressure that leads to the selection of resistant strains. In this context, previous studies conducted in the same laboratory where this thesis was carried out have shown that new compounds, characterized by N-benzyloxy-amino acid-hydroxamate (BAHs), are able, at non-cytotoxic concentrations, to significantly reduce both the activity of LasB elastase, which is an important virulence factor of P. aeruginosa, and biofilm formation. Furthermore, it has recently been demonstrated by other research groups that some hydroxamic derivatives also have anti-Quorum Sensing (QS) activity. QS is a communication mechanism between bacteria that allows them to coordinate group activities based on cell density. When a bacterial population reaches a sufficient number (a “quorum”), the signaling molecules it produces accumulate to a critical concentration, activating coordinated physiological responses such as biofilm formation, virulence factor synthesis, and the production of substances that promote survival.
This thesis aims to study the ability of certain BAHs to inhibit QS and the synthesis of virulence factors regulated by it in strains of P. aeruginosa isolated from patients with DCP. To this end, 16 strains of P. aeruginosa were initially characterized, isolated from the sputum of as many patients with DCP and referred to the Pediatric Clinic of the Pisa University Hospital. These bacterial strains were characterized both for their general properties (mucoid phenotype, antibiotic susceptibility, doubling time, and hydrogen peroxide tolerance) and for their ability to synthesize virulence factors directly or indirectly regulated by QS, including: LasB, an extracellular zinc-dependent metalloprotease; rhamnolipids, biosurfactants involved in biofilm formation; pyocyanin, a phenazine with cytotoxic activity; pyoverdin, a siderophore; pyrorubine, a pigment with antioxidant activity; swarming motility; and finally, the ability to form biofilms. The results indicated marked phenotypic variability among P. aeruginosa strains in their ability to produce the virulence factors considered. These results seem to overlap in part with those reported in the literature in patients with cystic fibrosis, in whom P. aeruginosa, as in the case of DCP, causes chronic infections that are difficult to eradicate.
In a second phase of the experimental work, the effect of BAHs on the synthesis of P. aeruginosa virulence factors was evaluated. Among all the strains previously characterized, the non-mucoid strain PaDCP-1 and the mucoid strain PaDCP-2 were selected, both characterized by their ability to produce high levels of virulence factors.
The anti-QS activity of BAHs was initially tested on Chromobacterium violaceum ATCC 12472, a bacterial strain known for producing violacein, a pigment whose synthesis is regulated by QS. The results showed more than 50% inhibition in violacein synthesis, and therefore QS, by the inhibitor RDL-135, tested at concentrations of 200µM, 100µM, and 50µM.
Once its anti-QS activity had been demonstrated, RL-135 was tested for its ability to inhibit the production of certain virulence factors, whose synthesis is regulated by QS, in the clinical strains PaDCP-1 and PaDCP-2. The results indicated that RDL-135 was able to significantly reduce both the synthesis of pyocyanin and rhamnolipids at non-cytotoxic concentrations between 50 and 100 µM. These preliminary results support the hypothesis that LasB inhibitors may represent a valid anti-virulence approach against P. aeruginosa, although further studies in in vivo models will be necessary to better evaluate their potential and limitations.