• Rett
• subcellular localisation
• foxg1

Rett syndrome is a severe neurodevelopmental disorder that represents one of the most common genetic causes of cognitive impairment in females (1 in 10.000 female births). Girls affected by classical RTT are characterized by an almost normal development in the first 6-18 months of life followed by a regression with loss of speech and physical impairment.

Mutations in the MeCP2 gene are responsible for more than 95% of classic Rett syndrome cases, while a CDKL5 mutation is responsible for the early onset seizures variant. FOXG1 gene has been identified as responsible of an atypical Rett syndrome form, the congenital variant: a form known as Rolando’s .

FOXG1 (forkhead box) is a transcriptional inhibitor, philogenetically conserved. It is composed of three main domains: a DNA binding domain (forkhead domain) and two other ones for binding of Groucho and Jarid, two co-repressors. FOXG1 is the most important gene for telencephalic development. It allows cellular proliferation and inhibits premature neuronal differentiation.

The main purpose of this thesis was to study the pathological protein R244C (mutated in the DNA binding domain) to understand its role in the Rett pathology.

To achieve the purpose, first FOXG1 mutated protein was studied to evaluate its ability to bind chromatin then, FOXG1 subcellular localisation was investigated.

To evaluate the chromatin affinity of the protein, hippocampal neuroblasts of the HN9.10e cells line were transfected with GFP-FOXG1 fusion protein and FRAP studies (Fluorescence Recovery After Photobleaching) was performed. FOXG1 mutated protein showed a lower affinity for chromatin which could lead to a diminished transcription of FOXG1 targets.
Confocal microscopy analysis showed that both the wild type and the mutated protein localize to mitochondria.
To better investigate this aspect, western blot assay were performed on cell fraction extracts both in vitro (on HN9.10e cells) and ex vivo (using cortex extracts from embryonic and adult mice). Results showed that FOXG1 is transported to the mitochondria with a potential-dependent mechanism. Inside mitochondria, FOXG1 undergoes specific processing that generates two smaller isoforms of the full length FOXG1.

TEM (Trasmission Electron Microscopy) analysis of murine cortex sections from a FOXG1 aploinsufficient mouse compared with the wild type littermate showed no ultra-structural mitochondrial alterations and no changes in the number or in the areas of these organelles.

In conclusion:
FRAP analysis on a mutated form of FOXG1 demonstrated that a point mutation itself can diminish chromatin affinity. This notion can be useful to understand the relationship between genotype and pathological phenotype of RTT, not yet clear.

The results indicate a specific FOXG1 processing inside the mitochondrial compartment. Moreover, aploinsufficiency does not alter mitochondrial number or mitochondrial ultrastructure.

Future studies will address the functional role of the mitochondrial isoforms of FOXG1.



La sindrome di Rett (RS) è una grave patologia del neurosviluppo che rappresenta una delle cause più comuni di disabilità intellettuale nelle bambine (1 su 10.000 bambine nate). Nella RS classica le pazienti mostrano un decorso perinatale normale entro i primi 6-18 mesi di vita, cui segue un arresto nello sviluppo psicomotorio e una progressiva regressione, fino a perdita del linguaggio e della deambulazione.
Mutazioni in MeCP2 sono responsabili di più del 95% dei casi di sindrome di Rett in forma classicat. Il gene CDKL5 è responsabile della variante con crisi epilettiche ad insorgenza precoce. Il gene FOXG1 (forkhead box) è stato identificato come responsabile della variante congenita, ad insorgenza precoce, nota anche come variante di Rolando .FOXG1 è un repressore trascrizionale, filogeneticamente conservato, costituito da tre domini principali: Il dominio di legame al DNA (forkhead domain) e i due domini per il legame ai co-repressori Groucho e Jarid.
FOXG1 svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo del telencefalo; la proteina agisce durante lo sviluppo embrionale promuovendo la proliferazione cellulare dei precursori neurogenici e inibendone il differenziamento precoce.
Lo scopo della mia tesi è stato quello di studiare la mutazione patologica R244C (collocata nel dominio di legame al DNA di FOXG1) per comprenderne il ruolo nella patogenesi della sindrome di Rett. Per questo, è stata prima valutata l’affinità di legame della proteina mutata, con il DNA; in seguito è stata caratterizzata la localizzazione sub-cellulare della proteina wild type.
Per valutare l’affinità di legame della proteina alla cromatina, sono stati transfettati neuroblasti ippocampali (HN9.10e) con la proteina FOXG1 fusa alla GFP, analizzando poi le cellule mediante la tecnica biofisica FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). I risultati hanno dimostrato una riduzione di affinità per la cromatina della proteina mutata rispetto alla forma wild type. Questo dato suggerisce una possibile alterazione della trascrizione dei geni target di FOXG1.
L’analisi mediante microscopia confocale ha evidenziato la localizzazione della proteina (sia wild type che mutata) a livello mitocondriale. Per caratterizzarne in dettaglio la localizzazione sub-cellulare sono stati utilizzati estratti cellulari sub-frazionati, ottenuti sia in vitro dalla linea cellulare HN9.10e che ex vivo da corteccia murina sia embrionale che adulta. Gli estratti sono stati analizzati mediante western blot.
I risultati hanno dimostrato che FOXG1 viene trasportato nei mitocondri con un meccanismo potenziale- dipendente. All’interno dei mitocondri la proteina viene processata in due isoforme più piccole rispetto alla forma full length.
L’analisi al TEM (Trasmission Electron Microscopy) di sezioni di corteccia di topi adulti aploinsufficienti per FOXG1 non ha mostrato alterazioni numeriche di questi organelli ne’ della loro ultrastruttura, suggerendo che l’aploinsufficienza di FOXG1 o delle sue isoforme non è un parametro determinante per la struttura dei mitocondri.
In conclusione: L’analisi mediante FRAP ha dimostrato come una singola mutazione puntiforme nel dominio di legame al DNA, possa da sola diminuire l’affinità di legame di FOXG1 per la cromatina. Ciò fornisce anche nuove informazioni che cercano di correlare il genotipo con il fenotipo patologico caratteristico della sindrome di Rett.
I risultati conseguiti hanno dimostrato una localizzazione e un successivo processamento di FOXG1 all’interno del compartimento mitocondriale. È stato inoltre appurato che l’ aploinsufficienza di FOXG1 non influenza l’ultrastruttura dei mitocondri.
Successivi sviluppi di questo studio saranno mirati alla comprensione del ruolo funzionale delle diverse isoforme mitocondriali di FOXG1.