• Alzheimer
• beta amiloide
• biosensori
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• quartz crystal microbalance

La Sindrome di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa progressiva ed è la più comune forma di demenza, rappresentando la quinta causa di morte nel mondo. La complessità della malattia deriva dalla sua eziologia multifattoriale, con componenti genetiche, ambientali e socioeconomiche. I sintomi dell'AD si manifestano tipicamente dopo i 65 anni e sono causati dall'accumulo di β-amiloide (Aβ) extracellulare e grovigli neurofibrillari di proteina τ iperfosforilata intracellulari, processi che portano a infiammazione, morte neuronale e declino cognitivo. Attualmente, non esiste una cura definitiva e le terapie utilizzate mirano solamente a ridurre l'infiammazione e rallentare il declino cognitivo. La diagnosi precoce è cruciale per migliorare la gestione della malattia, e biomarcatori come la proteina β-amiloide 42 (Aβ42) e la proteina τ fosforilata (P-tau181) presenti nei fluidi biologici forniscono indizi significativi. Nell’ottica di una diagnosi precoce, i biosensori rappresentano una soluzione promettente.
Lo scopo di questa tesi è quello di valutare diverse funzionalizzazioni chimiche di biosensori acustoelettrici basati su onde acustiche di tipo bulk (BAW) per il rilevamento delle proteine Aβ42 e Aβ40 nei fluidi biologici periferici, usando la tecnica della Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D).
Come biorecettori, sono state scelte due tipologie di molecole: anticorpi, immobilizzati sulla superficie del sensore tramite un linker di acido 12-mercaptododecanoico (12-MCA), e aptameri, modificati con l’aggiunta di un tiolo terminale e immobilizzati tramite un legame diretto con la superficie ricoperta d’oro del cristallo di quarzo. Con l’obbiettivo di determinare la migliore funzionalizzazione, per gli anticorpi, è stato effettuato uno screening di concentrazione dello strato di 12-MCA (adlayer) testando tre miscele a concentrazioni variabili fra 0.25 mg/ml e 1.00 mg/ml in presenza e in assenza di metossi-polietilenglicol (mPEG), utilizzata come agente antifouling. I risultati ottenuti suggeriscono la formazione di strati non diversi, in termini di massa adesa, per tutte le miscele di entrambe le tipologie di adlayer testate; si evidenzia però una tendenza di aumento di massa adesa dell’anticorpo sui cristalli funzionalizzati con l’adlayer PEGhilato con valori di 1.35 e 1.70 volte maggiori rispetto all’adlayer non PEGhilato rispettivamente per l’anti-Aβ42 e l’anti-Aβ40.
In termini di rilevazione proteica, i due anticorpi sono stati testati per le loro capacità di legame specifico, con soluzioni di proteine Aβ, e di legame aspecifico, con soluzioni di albumina da siero bovino (BSA). I test hanno evidenziato una migliore capacità di rilevazione della proteina Aβ42 sui sensori non PEGhilati e, al contrario, una migliore capacità di rilevazione della proteina Aβ40 sui sensori PEGhilati; non sono state osservate riduzioni sensibili dei segnali ottenuti dalla rilevazione della BSA da parte dei sensori PEGhilati.
In riferimento agli aptameri, è stata selezionata una molecola specifica per il legame della proteina Aβ40 con la quale è stato condotto uno screening su sette concentrazioni della soluzione funzionalizzante, da 5×10-3 μg/ml a 5×102 μg/ml per la determinazione della miscela in grado di saturare la superficie del sensore. Sono stati ottenuti i massimi valori di massa adesa con le miscele a concentrazione 0.825 μg/ml e 100 μg/ml rispettivamente in assenza e in presenza di mPEG corrispondenti a valori di 419 ng/cm2 e 501 ng/cm2. Utilizzando il modello di Langmuir, sono state costruite curve per descrivere la formazione del monostrato, con coefficienti di correlazione di R²=0.76 senza mPEG e R²=0.86 con mPEG.
In conclusione, questo lavoro ha fornito dati preliminari sulle funzionalizzazioni applicabili per i biosensori acustici. Tuttavia, alcuni aspetti come la riduzione ulteriore del segnale aspecifico e i limiti di rilevamento richiedono studi aggiuntivi, necessari per migliorare le prestazioni complessive del sensore, che in futuro potrebbe essere integrato come sistema diagnostico portatile per la diagnosi precoce di AD.



Alzheimer’s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of dementia, representing the fifth leading cause of death worldwide. The complexity of the disease arises from its multifactorial etiology, involving genetic, environmental, and socioeconomic factors. Symptoms of AD typically manifest after the age of 65 and are caused by the accumulation of extracellular β-amyloid (Aβ) and intracellular neurofibrillary tangles of hyperphosphorylated τ protein, processes that lead to inflammation, neuronal death, and cognitive decline. Currently, there is no definitive cure, and existing therapies aim only to reduce inflammation and slow cognitive decline. Early diagnosis is crucial for improving disease management, and biomarkers such as β-amyloid 42 (Aβ42) and phosphorylated τ protein (P-tau181) in biological fluids provide significant clues. In the context of early diagnosis, biosensors represent a promising solution.
The aim of this thesis is to evaluate various chemical functionalizations of bulk acoustic wave (BAW)-based acousto-electrical biosensors for the detection of Aβ42 and Aβ40 proteins in peripheral biological fluids, using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D) technique.
Two types of molecules were chosen as bioreceptors: antibodies, immobilized on the sensor surface via a 12-mercaptododecanoic acid (12-MCA) linker, and aptamers, modified with a terminal thiol group and immobilized through a direct bond with the gold-coated surface of the quartz crystal. To determine the best functionalization, an adlayer concentration screening was performed for antibodies by testing three mixtures with concentrations ranging from 0.25 mg/ml to 1.00 mg/ml in the presence and absence of methoxy-polyethylene glycol (mPEG), used as an antifouling agent. The results suggest no significant differences in the adhered mass for all mixtures of both types of adlayers tested. However, there was a trend toward increased antibody adhered mass on crystals functionalized with the PEGylated adlayer, with values 1.35 and 1.70 times greater compared to the non-PEGylated adlayer for anti-Aβ42 and anti-Aβ40, respectively.
In terms of protein detection, the two antibodies were tested for their specific binding capacities with Aβ protein solutions and nonspecific binding with bovine serum albumin (BSA) solutions. The tests revealed better detection of Aβ42 protein on non-PEGylated sensors and, conversely, better detection of Aβ40 protein on PEGylated sensors. No significant reductions in BSA detection signals were observed for the PEGylated sensors.
For aptamers, a molecule specific to Aβ40 protein binding was selected, and a screening was conducted using seven concentrations of the functionalizing solution, ranging from 5×10⁻³ μg/ml to 5×10² μg/ml, to determine the mixture capable of saturating the sensor surface. The highest adhered mass values were obtained with concentrations of 0.825 μg/ml and 100 μg/ml, corresponding to 419 ng/cm² and 501 ng/cm² in the absence and presence of mPEG, respectively. Using the Langmuir model, curves were constructed to describe monolayer formation, with correlation coefficients of R² = 0.76 without mPEG and R² = 0.86 with mPEG.
In conclusion, this work provides preliminary data on functionalizations applicable to acoustic biosensors. However, aspects such as further reduction of nonspecific signals and detection limits require additional studies to improve the sensor's overall performance. In the future, this sensor could be integrated as a portable diagnostic system for the early diagnosis of AD.