• nanorods
• photothermal
• terapia

Abstract
Nell'ultimo decennio le nanostrutture di metalli nobili sono state oggetto di un crescente interesse dovuto alle loro proprietà uniche. In particolare, il fenomeno chiamato risonanza plasmonica superficiale localizzata (Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR), che è particolarmente accentuato in nanostrutture di metalli nobili (oro e argento), produce significative modifiche delle proprietà di interazione con la radiazione elettromagnetica, portando a un incremento (anche di diversi ordini di grandezza) delle sezioni d'urto di assorbimento e scattering della luce in corrispondenza di determinati intervalli spettrali nel visibile o nel vicino infrarosso.
Oltre che in numerosi altri settori, la disponibilità di nanostrutture dotate di LSPR ha avuto un grande impatto nella nanomedicina, soprattutto in ambito oncologico, dove l'idea di base è quella di sfruttare le specifiche proprietà ottiche in tecniche per l'imaging e per la terapia fototermica. Quest'ultima, in particolare, stimola grande interesse per il trattamento di alcuni tumori, per esempio quelli epiteliali, situati a breve profondità rispetto alla pelle. Essa sfrutta l'assorbimento risonante di radiazione indotto dalle nanostrutture per provocare il riscaldamento locale (fotoablazione) e la distruzione delle cellule tumorali.

Questo lavoro di tesi, sviluppato in collaborazione con l'Istituto Italiano di Tecnologia (IIT) di Genova e il Dipartimento di Biologia dell'Università di Pisa consiste in un esperimento di fotoablazione di nanorods di oro (Gold NanoRods, GNRs), effettuato su delle cavie di Zebrafish tumorate con cellule di tumore umano mammario. A differenza di altri precedenti, lavori, la fotoablazione è condotta con radiazione laser continua focalizzata e indirizzata in regioni specifiche con un sistema di controllo a tre direzioni indipendente da quello di imaging.
Le cellule tumorali esprimono l'over-espressione del recettore Her2 e sono legate a un uoroforo (Alexa uor 555, derivato del TRITC), avente una banda di assorbimento con un massimo nella lunghezza d'onda del verde, e un massimo della banda di emissione nel rosso. L'uso del uoroforo consente di localizzare le cellule tumorali attraverso emissione di fluorescenza.
La LSPR risulta altamente sensibile alla natura dell'interfaccia con l'ambiente circostante, e alla forma e dimensioni delle nanostrutture. La posizione spettrale della risonanza può dunque essere spostata alle lunghezze d'onda di interesse, che in questo contesto sono quelle relativamente poco assorbite dall'acqua, e dunque dai tessuti. I GNRs utilizzati, di provenienza commerciale, presentano una risonanza attorno a 780 nm, come evidenziato da misure ottiche preliminari svolte presso IIT. Per consentirne il posizionamento nella massa tumorale, essi sono funzionalizzati con un anticorpo monoclonale (anti-Her-2) in grado di riconoscere e legarsi al recettore posto sulla membrana citoplasmatica cellulare, attraverso una specifica procedura sviluppata presso il Dipartimento di Biologia.
In sostanza, le diverse fasi dell'esperimento prevedono: (i) l'individuazione delle cellule tumorali all'interno di specifici organi della cavia attraverso imaging di fluorescenza; (ii) l'esposizione alla sorgente laser di fotoablazione in posizioni predeterminate e con dosi di energia variabili; (iii) la verifica dell'effetto di fotoablazione tramite imaging di fluorescenza a tempi successivi.
La realizzazione dell'esperimento ha comportato la messa a punto di uno specifico apparato sperimentale basato su un microscopio ottico invertito Nikon Ti-Eclipse. Il microscopio, normalmente impiegato per altri scopi, è stato equipaggiato con fotocamere C-MOS e una sorgente di illuminazione LED a luce "bianca" per la visualizzazione degli organi. Inoltre sono stati adattati al microscopio e testati diversi sistemi per l'imaging di fluorescenza in configurazione EPI (in riflessione), basati sia sulla configurazione standard della luce "bianca" filtrata spettralmente, che sull'impiego di una sorgente laser a 561 nm, opportunamente defocalizzata secondo le indicazioni di una
specifica simulazione analitica. Inoltre è stato sviluppato e caratterizzato, mediante misure di potenza e distribuzione spaziale, il sistema per l'invio controllato della radiazione di fotoablazione a 780 nm. A questo scopo è stato usato un laser a diodo accoppiato a una fibra ottica monomodo terminata con un obiettivo asferico a piccola distanza focale, montato su un traslatore micrometrico a tre direzioni, necessario per il posizionamento sulla regione di interesse.
L'esperimento è stato condotto su diverse cavie opportunamente fissate a vetrini porta-oggetto messi a punto per questa tesi. Il confronto tra le immagini di fluorescenza prima e dopo l'esposizione alla radiazione di fotoablazione, analizzate mediante diverse tecniche di trattamento immagini, ha mostrato in alcuni casi risultati incoraggianti per l'ulteriore sviluppo della tecnica. Tuttavia, pur in questa fase preliminare, l'esperimento ha mostrato alcuni limiti dovuti alla impossibilità di localizzare i GNRs con una risoluzione spaziale paragonabile alle dimensioni dello spot focale (circa 15 μm).
Sulla base dei risultati di questa tesi si prevede di modificare la procedura di funzionalizzazione dei GNRs in modo da integrare un ulteriore fluoroforo, con assorbimento nel blu ed emissione nel verde, da usare come marker per la localizzazione delle regioni maggiormente dense di GNRs.