• MVA
• Spindle checkpoint

La stabilità del genoma dipende dalla corretta segregazione dei cromosomi dalla cellula madre alle due cellule figlie durante il ciclo cellulare e in questo ambito il checkpoint del fuso mitotico (mitotic spindle checkpoint) è un meccanismo di sorveglianza cruciale per il mantenimento del corretto numero di cromosomi. Esso infatti controlla che i cromosomi siano correttamente posizionati sulla piastra metafasica e che siano legati ai microtubuli del fuso. In presenza di un cromosoma non legato, il checkpoint del fuso mitotico è in grado di bloccare la progressione metafase/anafase. Numerose proteine contribuiscono all’azione del checkpoint tra cui MAD1, MAD2, BUBR1, BUB1 e BUB3. Queste proteine regolano la capacità di Cdc20 di attivare l’APC/C, un complesso con attività ubiquitina ligasi che è responsabile della ubiquitinazione di alcune proteine chiave del ciclo cellulare tra cui la ciclina B e la securina.
È stato ipotizzato che mutazioni nei geni coinvolti nel checkpoint del fuso mitotico possano essere alla base dell’Aneuploidia Variegata a Mosaico (MVA), una malattia molto rara, a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata da aneuploidia a mosaico, soprattutto trisomie e monosomie, che coinvolgono differenti cromosomi e tessuti. La proporzione di cellule aneuploidi varia ed è maggiore che negli individui normali. Gli individui affetti solitamente presentano un severo ritardo nella crescita pre- e post-natale. Inoltre sono caratterizzati da microcefalia, lieve dismorfismo, difetti oculari, e un ampio spettro di anormalità congenite. Infine tali pazienti mostrano un elevato rischio di sviluppare tumori, come le leucemie e il tumore di Wilms. Recentemente e’ stato dimostrato che mutazioni a carico dei geni BUB1R ed CEP57 sono responsabili della MVA. BUBR1 fosforila CENP-E contribuendo all’allineamento dei cromosomi mentre CEP57 è una proteina centrosomiale coinvolta nella stabilizzazione dei microtubuli. Tuttavia le mutazioni in tali geni non spiegano tutti i casi di MVA suggerendo che tale sindrome è geneticamente eterogenea.
In questo lavoro di tesi mi sono occupato di caratterizzare una linea fibroblastica proveniente da un paziente affetto da MVA. Prima di tutto ho sequenziato le sequenze codificanti dei geni BUB1R e CEP57 noti essere responsabili della sindrome. I risultati hanno mostrato che la linea cellulare è negativa per mutazioni a carico di tali geni. Successivamente ho sequenziato le regioni promotrici e nel caso di BUB1R ho effettuato esperimenti di western blotting che hanno confermato che tale gene viene normalmente trascritto e tradotto. Questi esperimenti indicano che i geni BUB1R e CEP57 non sono responsabili della MVA nel nostro paziente.
Fino ad oggi, tutte le mutazioni note nei geni BUB1R e CEP57 causano la terminazione precoce della sintesi proteica con mancanza delle proteine. Pertanto come sviluppo successivo di questo internato di tesi, ho eseguito una serie di western blotting utilizzando una batteria di anticorpi diretti contro proteine coinvolte nel checkpoint del fuso mitotico al fine di identificare una proteina che viene poco o niente sintetizzata.