• cervello
• espressione genica
• SSH

Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca finalizzato ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi nelle strutture telencefaliche (ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) coinvolte in processi di apprendimento, in ratti sottoposti al paradigma comportamentale del contextual fear conditioning.
Molte informazioni sulla memoria e sull’apprendimento associativo derivano da studi di condizionamento classico svolti sia su vertebrati che invertebrati. Tale procedura implica la formazione di un’associazione tra stimoli e/o risposte, in quanto uno stimolo neutro chiamato stimolo condizionato (SC) è associato ad uno stimolo che normalmente evoca una risposta fisiologica chiamato stimolo incondizionato (SI). Accoppiando ripetutamente i due stimoli anche il solo stimolo condizionato è in grado di generare la risposta.
Una forma di condizionamento classico è il condizionamento alla paura o classical fear conditioning, basato su processi neurali di apprendimento e memoria che permettono di rispondere in maniera efficace a stimoli, che altrimenti non indurrebbero risposte spostanee di paura. In tale paradigma comportamentale l’amigdala svolge un ruolo chiave indipendentemente dalle modalità sensoriali usate come CS. Anche l’ambiente dove viene presentato SI può assumere caratteristiche di SC inducendo risposte che vengono definite di paura condizionata al contesto. In questa forma di condizionamento al contesto, contextual fear conditioning, si ha l’attivazione dell’amigdala, della corteccia peririnale e soprattutto dell’ippocampo. Animali sottoposti al contextual fear conditioning mostrano una risposta comportamentale alla paura che è quella dell’immobilità o freezing ogni volta che sono inseriti nell’apparato di condizionamento (retrieval test). Registrazione elettrofisiologiche effettuate su slices di ippocampo di ratti condizionati evidenziano la comparsa di una forma più duratura di LTP (detta LTP tardiva), che dura almeno 24 ore e comporta la sintesi di nuovo mRNA il quale a sua volta può essere usato per ottenere cambiamenti strutturali persistenti. Per individuare i possibili geni coinvolti in tali modificazioni abbiamo utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive Hybridisation, SSH). L’SSH rappresenta un efficiente metodo che tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, permette l’isolamento di sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame. In particolare l’efficienza dell’SSH consiste nella capacità di isolare anche i trascritti più rari non evidenziabili con altre tecniche che evidenziano pattern di espressione genica. Nel test da noi utilizzato l’animale viene inserito nell’apparato di condizionamento, dopo tre minuti viene sottoposto ad un training di sette scosse elettriche (ciascuna dell’intensità di 1 mA e della durata di 1 secondo e intervallate 30 secondi l’una dall’altra), terminata la sessione di condizionamento l’animale resta nell’apparato di condizionamento per altri tre minuti e successivamente viene trasferito nella propria home box. A 48 ore di distanza dal condizionamento, i cervelli sia degli animali condizionati che dei controlli ( animali mai entrati nell’apparato di condizionamento) sono stati estratti e sezionati in tre parti: anteriore, medio-temporale ( ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) e posteriore (cervelletto e bulbo). L’RNA poliA+ estratto dalle sezioni medio-temporali degli animali condizionati e dei controlli viene utilizzato per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA. Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione i cDNA vengono clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali, ottenute con sequenziatore automatico, sono analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite programmi come FASTA, BLASTIX e BLASTN. La reale espressione differenziale sarà poi analizzata mediante RT-PCR relativa.