• cellule beta pancreatiche
• diabete mellito 1
• GLP-1R
• modello in vitro di diabete di tipo 1
• stimolo proinfiammatorio
• ZnT8

Il diabete mellito di tipo 1 (T1D) è una patologia caratterizzata da iperglicemia dovuta a un deficit nella produzione dell’insulina, con conseguenze sul metabolismo di proteine e lipidi. I sintomi includono poliuria, sete, disturbi visivi e perdita di peso che possono evolvere in condizioni più gravi come chetoacidosi e coma diabetico se non farmacologicamente trattato. Il T1D è una malattia autoimmune che rappresenta circa il 5-10% dei casi di diabete e colpisce prevalentemente bambini e ragazzi, con il più alto tasso di insorgenza tra i 10 ed i 14 anni. A livello globale, i paesi ad alto reddito registrano il maggior numero di casi, mentre quelli a basso reddito mostrano tassi di mortalità più elevati a causa di condizioni sanitarie insufficienti.
Le complicanze più comuni sono rappresentate da malattie cardiovascolari, renali e retinopatie che possono portare a morte del paziente, se non trattate tempestivamente. Nonostante i progressi nei trattamenti con insulina e monitoraggio glicemico, la mortalità ad oggi rimane ancora elevata.
Per effettuare diagnosi di T1D è necessario effettuare esami preliminari come glicemia, glicosuria, chetonuria, chetonemia, emoglobina glicosilata. In particolare, elevati livelli di glicemia a digiuno ( 126 mg/dl), confermato in almeno due distinte analisi ematochimiche o di valori elevanti di emoglobina glicata (HbA1c) ( 6.5 %) contribuiscono a determinare T1D. La ricerca degli autoanticorpi è diventata cruciale nel diagnosticare T1D: in particolare la presenza di autoanticorpi diretti contro il citoplasma delle cellule dell’insula pancreatica (ICA), contro l’insulina (IAA), contro la decarbossilasi dell’acido glutammico (GADA), dalla tirosina-fosfatasi (IA2) e, più recentemente, contro il trasportatore 8 dello zinco (ZnT8) contribuiscono a distinguere il T1D da altre forme di diabete.
L’eziologia è multifattoriale, con una combinazione di fattori genetici ed ambientali che aumentano la suscettibilità alla malattia.
Il T1D è definito come patologia immunomediata. Infatti, i linfociti T, in particolare i CD4+ e i CD8+, sono i principali componenti del sistema immunitario che si attivano nelle prime fasi di T1D. I CD8+ attaccano direttamente le cellule β, mentre i CD4+ rilasciano citochine pro-infiammatorie. L’attivazione immunitaria innesca una risposta pro-infiammatoria esacerbata con il conseguente rilascio di citochine, tra cui TNF-α, IL-1β e IFN-γ con effetti pro-apoptotici. Esse inoltre sono in grado di attivare il fattore NF-kB il quale, dopo traslocazione nucleare, contribuisce alla morte delle cellule β.
Il controllo della glicemia è principalmente attribuibile all’insulina, un ormone prodotto dalle cellule β all’interno delle isole di Langherans del pancreas. Dopo un pasto, il glucosio attiva via di segnalazione intracellulari nelle cellule β, stimolando la loro produzione e secrezione di granuli di insulina. Lo ione Zn2+ svolge un ruolo principale nel rilascio dell’insulina, poiché il suo accumulo a livello dei granuli è necessario per la maturazione ed il rilascio dell’insulina indotta da glucosio (glucose-stimulated insulin secretion, GSIS). L’omeostasi dello ione è garantita da vari trasportatori, tra cui lo ZnT8, la cui disfunzione è associata a patologie autoimmuni come il T1D.
Oltre alla regolazione da parte del glucosio, la produzione ed il rilascio di insulina è modulata anche da ormoni incretinici, come il GLP-1. Questo è secreto dalle cellule L intestinali e i suoi livelli aumentano rapidamente dopo un pasto. Il GLP-1 stimola la secrezione di insulina e inibisce quella di glucagone dalle cellule α, mediante il legame col suo recettore (GLP1R).
La complessa interazione tra cellule immunitarie e cellule β del pancreas nella patogenesi del T1D è spesso complicata da riprodurre in modelli in vitro per lo studio di meccanismi patogenici e di potenziali nuovi target terapeutici.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare un nuovo modello di cellule β pancreatiche umane in presenza di glucosio e stimoli infiammatori, soprattutto in relazione all’espressione di ZnT8 e GLP1R ed all’attivazione di vie di segnalazione intracellulare di tipo apoptotico ed infiammatorio, come potenziale modello di T1D.
Innanzitutto, per valutare la funzionalità cellulare, le cellule β pancreatiche umane sono state trattate con una concentrazione di 20mM ed è stata quantificata l’insulina rilasciata tramite un saggio immunoenzimatico (ELISA). Una volta confermata la capacità delle cellule di secernere insulina, sono state trattate con diverse concentrazioni di glucosio o interleuchine, così da mimare il pathway GSIS e l’infiammazione presente in queste cellule in presenza di T1D.
Le cellule β pancreatiche umane sono state seminate e trattate per un’ora con concentrazioni di glucosio crescenti (2mM e 20mM). Attraverso la tecnica dell’immunofluorescenza, è stata studiata la variazione dell’espressione di ZnT8 e GLP1R in risposta al glucosio e quindi il loro coinvolgimento nella produzione di insulina.
Parallelamente, le cellule β pancreatiche umane sono state seminate e sottoposte a stimolazioni con citochine pro-infiammatorie per 24 ore. In particolare, è stata utilizzata una mix di IL-1β, TNFα e IFNγ per mimare la condizione di diabete precoce, e l’IFNα per mimare una condizione di diabete avanzato. L’efficacia di ciascuno stimolo infiammatorio è stata valutata mediante l’espressione della caspasi-3 e l’attivazione di NF-kB, marker di apoptosi e fattore di trascrizione pro-infiammatorio, rispettivamente. Infine, è stata valutata l’espressione di ZnT8 e GLP1R dipendente dai due stimoli infiammatori proposti.
I risultati ottenuti mostrano l’abilità delle cellule cellule β pancreatiche umane nel mimare efficacemente il pathway GSIS, soprattutto in relazione all’espressione di ZnT8 e GLP1R. Inoltre, gli stimoli infiammatori proposti riescono ad indurre un aumento dell’espressione di caspasi-3 e della traslocazione nucleare di NF-kB, dimostrando quindi un’aumentata apoptosi ed infiammazione, caratteristiche distintive delle cellule β pancreatiche nel T1D. Infine, l’espressione di ZnT8 sulla membrana cellulare è risultata significativamente aumentata in seguito a stimolo infiammatorio la mix di IL-1β, TNFα e IFNγ, mimando l’esposizione di neo-epitopi di superficie, con particolare riferimento al T1D ad insorgenza precoce.
Nel complesso, il presente lavoro di tesi mostra evidenze riguardo l’utilizzo di cellule β pancreatiche umane come buon modello per mimare il T1D in vitro, soprattutto in seguito a stimolo infiammatorio. Questo modello potrà essere utilizzato in futuro per lo screening di potenziali nuovi farmaci per T1D, offrendo uno strumento utile per lo sviluppo di nuove terapie all’avanguardia.