• contextual fear conditioning
• PCR real-time
• SSH

Questa tesi sperimentale si inserisce in un progetto di ricerca finalizzato allo studio delle modificazioni dell’espressione genica nelle strutture cerebrali coinvolte nell’ apprendimento contestuale alla paura nel ratto. Molte delle informazioni sulla memoria emozionale e sull’apprendimento associativo alla paura derivano da studi di condizionamento classico. Una particolare forma di condizionamento classico alla paura è il classical fear conditioning un paradigma comportamentale dipendente in gran parte dall’ attivazione dell’ amigdala. Il condizionamento contestuale alla paura o contextual fear conditioning (CFC), invece, richiede sia l’ attivazione dell’ amigdala che dell’ ippocampo, in quanto anche l’ambiente dove viene presentato lo stimolo può indurre risposte, che vengono definite di paura, condizionata al contesto. Animali sottoposti al CFC mostrano la tipica risposta comportamentale alla paura, definita freezing, ogni volta che vengono reinseriti nello stesso apparato di condizionamento (retrieval test). Tale risposta perdura per 4 settimane dopo l’addestramento. Registrazioni elettrofisiologiche eseguite su slices di ippocampo di ratti condizionati hanno evidenziano modificazioni dell’eccitabilità sinaptica che perdura per circa 7 giorni. Tali effetti duraturi nel tempo hanno suggerito l’ipotesi che, in seguito al CFC, avvenga una sintesi differenziale di mRNA e/o una neosintesi di proteine nel sistema nervoso dei ratti. Per individuare i geni coinvolti in tali modificazioni abbiamo utilizzato la tecnica dell’ ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive hybridisation, SSH), comparando 48 ore dopo il condizionamento, i trascritti isolati dalle regioni medio-temporali del cervello di ratti sottoposti a CFC a quelli isolati dai ratti di controllo, mai entrati nell’apparato di condizionamento. L’SSH permette l’isolamento di sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA (partendo dagli mRNA poliA+ estratti dai ratti trattati e dai controlli). L’efficienza dell’SSH consiste in particolar modo nella capacità di isolare anche i trascritti più rari o poco espressi non evidenziabili con altre tecniche. Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione i cDNA sono stati clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali, tramite sequenziamento automatico, sono state analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite programmi come FASTA e BLAST. In base alla funzione fisiologica svolta dalle proteine tradotte, i cloni sono stati divisi nelle seguenti categorie funzionali, quali: metabolismo energetico mitocondriale, formazione, trasporto e rilascio delle vescicole, meccanismi di trasduzione dei segnali e turn-over proteico. In particolare, in questo lavoro di tesi, si discutono risultati di esperimenti di analisi di espressione genica condotte utilizzando la PCR real-time. Tale tecnica detta anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR) permette amplificazione e quantificazione simultanee del materiale nucleico. In particolare sono state analizzate e discusse le sequenze di cloni che hanno mostrato un’elevata omologia con le sequenze di geni codificanti per proteine note, quali l’ amfifisina, la caspasi 3, la p53 e la statmina.