ETD

• GTF2I
• mutazioni somatiche
• somatic mutations
• thymic epithelial tumors
• tumori epiteliali del timo

I tumori epiteliali del timo sono neoplasie rare che comprendono i timomi e i carcinomi timici. I timomi si suddividono ulteriormente in istotipi A, AB, B1, B2 e B3. La patogenesi molecolare di queste neoplasie è solo parzialmente compresa. La mutazione del gene GTF2I è presente in circa il 30–50% dei casi, superando l’80% nei timomi di tipo A e AB e diminuendo progressivamente nei timomi di tipo B1, B2 e B3 e nei carcinomi del timo. GTF2I mutato è un oncogene in grado di determinare la formazione di timomi in modelli murini transgenici. Tuttavia, le alterazioni molecolari che caratterizzano i tumori epiteliali del timo privi di mutazioni di GTF2I restano in gran parte da chiarirte.
Pertanto, abbiamo condotto una revisione sistematica della letteratura relativa agli studi di next-generation sequencing sui tumori epiteliali timici, identificando le mutazioni più frequenti. Sulla base dei dati raccolti, è stato da noi progettato un pannello personalizzato di 77 geni utilizzando il software Design Studio di Illumina per la generazione di librerie genomiche tramite il kit DNA Prep Enrichment della stessa azienda. Per identificare le mutazioni somatiche abbiamo sequenziato il DNA tumorale da tessuto congelato e il DNA germinale prelevato dal sangue periferico di 70 pazienti sottoposti a resezione chirurgica presso l’Università di Pisa nell’ambito del protocollo di studio clinico traslazionale Tymogene. Inoltre, per 19 campioni abbiamo provveduto a dissociare a fresco la biospia tissutale, per valutare la percentuale di cellule epiteliali nel campione e, nei casi con materiale sufficiente, procedere all’isolamento e al sequenziamento del DNA.
La mutazione missenso L424H di GTF2I è stata identificata nel 41% dei casi, principalmente nei timomi di tipo A e AB e negli stadi I–II, suggerendo una possibile associazione con forme a comportamento biologico meno aggressivo. Abbiamo riscontrato un pattern di comutazioni e mutazioni mutualmente esclusive tra GTF2I e gli altri geni studiati, che suggerisce una patogenesi alternativa dei tumori epiteliali del timo, con o senza mutazione di GTF2I. Le mutazioni somatiche sono state identificate nel 61% dei pazienti, di cui 9 con più di due mutazioni, 10 con due mutazioni e 24 con un'unica mutazione. Nonostante l’elevata profondità di sequenziamento, 27 tumori (39%) non hanno mostrato mutazioni somatiche identificabili. L’analisi dei campioni dissociati ha evidenziato che, in alcuni casi, la bassa percentuale di cellule epiteliali neoplastiche rispetto ai numerosi timociti non neoplastici di accompagnamento potrebbe spiegare l’incapacità di identificare alterazioni genomiche.
In conclusione, le mutazioni di GTF2I rappresentano un evento chiave nella crescita di una parte significativa dei tumori epiteliali del timo, talvolta in concomitanza con altre alterazioni geniche. Tuttavia, i meccanismi molecolari fondamentali che determinano la trasformazione neoplastica nei casi privi della mutazione di GTF2I restano elusivi anche con l’approccio di sequenziamento dedicato ai tumori epiteliali del timo da noi sviluppato. In previsione di tale problema, abbiamo valutato un metodo di isolamento delle cellule tumorali mediante dissociazione e sorting delle cellule EPCAM positive, che potrebbe essere un modo per studiare questi tumori. Tuttavia, la bassa resa in termini di cellule isolate limita quest’approccio. Pertanto, l’utilizzo di tecnologie di genotipizzazione ancora più sensibili, in grado di valutare geni di fusione e copy number aberrations , potrà essere preso in considerazione nelle analisi future.

Thymic epithelial tumors are rare neoplasms, including thymomas and thymic carcinomas. Thymomas are further divided into histotypes A, AB, B1, B2, and B3. The molecular pathogenesis of these neoplasms is only partially understood. Mutations in the GTF2I gene are detected in approximately 30–50% of cases, exceeding 80% in type A and AB thymomas, and progressively decreasing in type B1, B2, and B3 thymomas and in thymic carcinomas. Mutant GTF2I acts as an oncogene capable of inducing thymoma formation in transgenic mouse models. However, the molecular alterations characterizing GTF2I–wild-type thymic epithelial tumors remain largely unclear.
Therefore, we conducted a systematic review of the literature on next-generation sequencing studies of thymic epithelial tumors, identifying the most frequently mutated genes. Based on these data, we designed a custom panel of 77 genes using Illumina’s Design Studio software to generate genomic libraries with the company’s DNA Prep Enrichment kit. To identify somatic mutations, we sequenced tumor DNA from frozen tissue and germline DNA from peripheral blood in 70 patients who underwent surgical resection at the University of Pisa within the framework of the translational clinical study protocol Tymogene. Additionally, for 19 samples, we freshly dissociated the tissue biopsy to assess the percentage of epithelial cells and, in cases with sufficient material, proceeded to isolate and sequence the DNA.
The GTF2I missense mutation L424H was identified in 41% of cases, mainly in type A and AB thymomas and in stage I–II tumors, suggesting a possible association with a less aggressive biological behavior. We observed a pattern of co-mutations and mutual exclusivity between GTF2I and other studied genes, suggesting alternative pathogenic mechanisms in thymic epithelial tumors, depending on GTF2I mutational status. Somatic mutations were detected in 61% of patients: 9 cases showed more than two mutations, 10 had two mutations, and 24 had a single mutation. Despite the high sequencing depth, 27 tumors (39%) showed no identifiable somatic mutations. Analysis of the dissociated samples revealed that, in some cases, the low percentage of neoplastic epithelial cells relative to the numerous accompanying non-neoplastic thymocytes might explain the failure to detect genomic alterations.
In conclusion, GTF2I mutations represent a key event in the growth of a significant subset of thymic epithelial tumors, sometimes in combination with other genetic alterations. However, the fundamental molecular mechanisms driving neoplastic transformation in GTF2I–wild-type cases remain elusive, even with our dedicated sequencing approach for thymic epithelial tumors. To address this limitation, we evaluated a method for isolating tumor cells by dissociating and sorting EPCAM-positive cells, which may provide a useful tool for studying these tumors. Nevertheless, the low yield of isolated cells currently limits this approach. Therefore, the application of more sensitive genotyping technologies—capable of detecting gene fusions and copy number aberrations—should be considered for future analyses.