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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-10082021-101429


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale LM6
Autore
MORANI, CAMILLA
URN
etd-10082021-101429
Titolo
Un approccio biologico di studio dell'infiammazione nella broncopneumopatia cronica ostruttiva: potenziale ruolo proinfiammatorio delle vescicole extracellulari
Dipartimento
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Relatori
relatore Prof. Celi, Alessandro
correlatore Dott. Nieri, Dario
Parole chiave
  • broncopneumopatia cronica ostruttiva
  • citochine
  • infiammazione
  • vescicole extracellulari
Data inizio appello
26/10/2021
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
26/10/2024
Riassunto
La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è definita dal documento GOLD come “una malattia comune, prevenibile e trattabile, caratterizzata da sintomi respiratori persistenti e da una limitazione persistente al flusso aereo, che è dovuta ad anomalie delle vie aeree e/o degli alveoli, solitamente causate da una significativa esposizione a particelle o gas nocivi”.
Le riacutizzazioni di BPCO e le comorbidità sono un aspetto fondamentale della malattia. Alla base di queste due condizioni ci sono dei processi infiammatori complessi. Infatti, nella patogenesi della BPCO, possiamo distinguere un’infiammazione “locale”, a livello polmonare, e un’infiammazione “sistemica”, quest’ultima dovuta allo “spill-over” di citochine che, dalle vie aeree periferiche, si riversano nel circolo sistemico, potendo influenzare la funzione di altri organi e apparati. Si parla di una “sindrome infiammatoria sistemica cronica” per definire lo stato infiammatorio comune alla BPCO e alle comorbidità. Questa elevata attività infiammatoria è rilevata in corso di riacutizzazione di malattia. I processi infiammatori sembrano essere coinvolti negli eventi apoptotici alla base della patogenesi dell’enfisema, aspetto caratteristico della BPCO.
Le EV sono delle vescicole membranose rilasciate da quasi tutte le cellule che sono state proposte come valido marcatore per alcuni aspetti fondamentali della BPCO. Si ritiene che le EV possano essere coinvolte nei meccanismi patogenetici di molte patologie, tra cui i processi infiammatori, motivo per cui sta aumentando l’interesse al possibile ruolo delle EV come effettori di malattia.
Lo scopo del presente studio è quello di valutare, utilizzando un modello di biologia cellulare con una linea di epitelio bronchiale umano, la potenziale attività proinfiammatoria delle EV circolanti di pazienti affetti da BPCO (sia in fase di riacutizzazione che in fase di stabilità di malattia) rispetto ad una popolazione di soggetti non affetti, appaiati per età. Tale attività sarà valutata in termini di produzione di citochine proinfiammatorie (interleuchina-8 [IL-8], reclutante i neutrofili e chemochina chemottrattante-2 [CCL-2], reclutante i monociti) da parte delle cellule epiteliali stimolate con le EV dei soggetti in studio.
L’ipotesi di lavoro è che nei pazienti affetti da BPCO la risposta infiammatoria possa essere più spiccata che nei controlli, e maggiore durante la riacutizzazione che in fase stabile.
Il campione in studio comprende tre gruppi di soggetti: pazienti con diagnosi di riacutizzazione di BPCO con accesso in Pronto Soccorso, pazienti con diagnosi di BPCO in fase di stabilità, controlli non affetti appaiati per età. È stato condotto uno studio osservazionale a disegno cross-sectional in cui i tre gruppi di soggetti sono stati così valutati: i pazienti con presunta diagnosi di riacutizzazione di BPCO sono stati valutati entro 48 ore dall’accesso in Pronto Soccorso con raccolta anamnestica di dati antropometrici e clinici basali e prelievo ematico per EV (gli stessi pazienti sono stati rivisti in ambulatorio dopo 6-8 settimane dall’evento acuto per eseguire spirometria e confermare la diagnosi); i pazienti con diagnosi di BPCO accertata in fase stabile sono stati valutati con raccolta anamnestica di dati antropometrici e clinici basali, somministrazione dei questionari Medical Research Council modificato (mMRC) e COPD Assessment Test (CAT), spirometria, prelievo ematico per EV; i soggetti controllo sani sono stati valutati con raccolta anamnestica dei dati antropometrici e clinici basali, somministrazione dei questionari mMRC e CAT, prelievo ematico per EV.
Le EV circolanti sono state ottenute da 4 mL di sangue periferico raccolto in una provetta contenente sodio citrato. L’analisi delle concentrazioni delle EV è stata effettuata utilizzando un test commercialmente disponibile (Zymuphen MP-activity), basato sulla rilevazione delle nM di fosfatidilserina sulle EV. Per la valutazione dell’attività proinfiammatoria delle EV sono state utilizzate le cellule della linea cellulare epiteliale bronchiali umane 16HBE immortalizzate con SV40, che sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e stimolate con il pellet delle EV per 18 ore. Trascorse 18 ore il sovranatante è stato recuperato e centrifugato per valutare la concentrazione delle due citochine proinfiammatorie, IL-8 e CCL-2.
Per l’analisi statistica dei risultati è stato utilizzato il programma SPSS 20.0®, assumendo come livello di significatività una p inferiore a 0,05.
I tre gruppi del campione in studio (n = 24), cioè i 10 pazienti con presunta diagnosi di BPCO con accesso al Pronto Soccorso, 9 pazienti con diagnosi di BPCO in fase stabile e 5 controlli sani, sono stati ulteriormente suddivisi come segue: 6 pazienti con diagnosi certa di riacutizzazione di BPCO, cioè valutati in Pronto Soccorso e in ambulatorio (R); 9 pazienti con diagnosi di BPCO in fase di stabilità (S); 5 controlli sani (C); 4 pazienti con presunta diagnosi di riacutizzazione di BPCO, cioè valutati soltanto in Pronto Soccorso (persi).
I pazienti del gruppo R di cui è stata valutata l’attività proinfiammatoria in vitro delle EV sono 3. Di questi, solo in uno è stato possibile ottenere una spirometria che ha consentito una diagnosi definitiva di BPCO.
Per quanto riguarda le concentrazioni delle EV, osserviamo una differenza significativa (p=0,01) tra i valori di EV rilevate nei pazienti R e nei soggetti C e una differenza significativa (p=0,028) tra i valori di EV nei pazienti R e nei pazienti S.
Per quanto riguarda le concentrazioni delle citochine IL-8 e CCL-2, prodotte dalle cellule epiteliali dopo stimolazione con EV, osserviamo una differenza significativa (p=0,032) tra i valori di IL-8 dei pazienti R e dei soggetti C, e una differenza non significativa ma tendenziale (p=0,052) tra i valori di CCL-2 dei pazienti R e dei soggetti C.
Il primo risultato ottenuto è che i pazienti affetti da BPCO in fase di riacutizzazione presentano livelli significativamente più alti di EV rispetto a pazienti affetti da BPCO in fase di stabilità e a controlli non affetti, appaiati per età. Tali dati sono in linea con quelli riportati in Letteratura. Sempre sulla base dei dati di Letteratura, è ragionevole supporre che il rialzo delle EV sia legato all’incremento acuto dell’infiammazione, sia locale che sistemica, in corso di riacutizzazione di malattia; tale ipotesi è sostenuta da un studio condotto da Eltom e collaboratori su modello murino che mostra a livello polmonare la produzione, a seguito di insulto infettivo, di EV che, se opportunamente stimolate con adenosinatrifosfato (rilasciato anch’esso a seguito di insulto infiammatorio/infettivo), provocano un ulteriore rilascio di citochine. Era già noto da altri studi un incremento del numero delle EV nelle vie aeree dei pazienti con BPCO rispetto ai fumatori senza ostruzione al flusso e ai controlli sani, lasciando pensare ad una condizione flogistica propria della BPCO e distinta da quella evocata dal fumo di sigaretta.
Il secondo risultato rilevante si ottiene dall’incubazione delle EV dei pazienti in fase di riacutizzazione, dei pazienti in fase stabile e dei controlli con una linea cellulare di epitelio bronchiale. Da tale test in vitro, osserviamo che le EV dei pazienti riacutizzati inducono una produzione significativamente più elevata di IL-8 e CCL-2 da parte delle cellule epiteliali stesse, rispetto ai soggetti di controllo. IL-8 e CCL-2 sono citochine reclutanti neutrofili e monociti, rispettivamente, popolazioni cellulari essenziali nei processi infiammatori delle vie aeree caratterizzanti la BPCO. L’incremento delle citochine infiammatorie, insieme all’aumento delle EV, è coerente con lo studio di Eltom precedentemente citato, nel quale le EV svolgono, a loro volta, un ruolo proinfiammatorio che potrebbe perpetrare la flogosi caratteristica della riacutizzazione di BPCO. Inoltre, tali risultati sono coerenti con lo “spill-over” dell’infiammazione citato precedentemente. Alcuni studi in vitro, oltre a quello in vivo appena descritto, hanno studiato il potenziale effetto di alcuni sottogruppi di EV su diverse popolazioni cellulari, mostrando la capacità delle EV di indurre il rilascio di citochine da parte di vari tipi di cellule stimolate. Inoltre, è stato provato in vitro che stimoli irritanti/infiammatori inducono la produzione di EV da parte delle cellule stimolate. I dati appena descritti sono coerenti con quelli del presente studio, il quale è stato tuttavia condotto con l’utilizzo delle EV circolanti di pazienti affetti, sia riacutizzati che stabili, a differenza dei modelli descritti, mostrando un’attività biologica di natura proinfiammatoria delle EV di questi pazienti.
Il principale punto di forza dello studio consiste appunto nell’uso di un modello di biologia cellulare per descrivere il potenziale ruolo proinfiammatorio delle EV nella BPCO, mentre nei precedenti studi sono state valutate le EV provenienti da modelli animali o da volontari sani.
I principali limiti dello studio sono la piccola popolazione in studio ed il fatto che, dei tre pazienti riacutizzati, soltanto uno ha diagnosi certa di riacutizzazione di BPCO, mentre per gli altri due essa è molto probabile sulla base dei dati clinici ottenuti al Pronto Soccorso, ma i pazienti non hanno poi svolto la valutazione di conferma a 6-8 settimane.
I risultati ottenuti dal presente studio, seppure con i limiti suddetti, mostrano come le EV, oltre a rappresentare dei potenziali biomarcatori di malattia, possono svolgere un ruolo biologico nell’indurre e propagare la risposta infiammatoria acuta durante una riacutizzazione di BPCO. L’uso di un modello di biologia cellulare nello studio degli effetti delle EV nella BPCO rappresenta un innovativo approccio sperimentale che può meritare ulteriori approfondimenti su una casistica più ampia, in modo da far luce su alcuni meccanismi biologici alla base di questa malattia. Inoltre, una migliore definizione di questi processi potrebbe avere portare anche ad un risvolto in termini di trattamento.

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