• beta glucosidasi
• complessi umo-enzimaici
• enzimi
• terreno

L'ecosistema suolo è ricco di proteine enzimatiche che possono essere raggruppate in due classi: intracellulari ed extracellulari.
L'attività degli enzimi intracellulari dipende dalla proliferazione microbica a differenza dell'attività di quelli extracellulari che vengono secreti nella fase acquosa del terreno da cellule microbiche e vegetali metabolicamente attive o in fase di lisi. Tali enzimi possono trovarsi liberi o stabilizzati dalla formazione di complessi con le sostanze umiche e le argille del terreno, sono considerati una riserva di materia ed energia biochimica del suolo in quanto la loro attività si svolge anche in condizioni proibitive per i microrganismi e, per questo, sono stati proposti come le ultime difese biologiche del suolo esposto a processi di degradazione irreversibili come la desertificazione.
Il loro isolamento richiede studi laboriosi a causa della complessa matrice rappresentata dal terreno; e a causa dell'eventuale formazione dei suddetti complessi.
In questo lavoro di tesi si mira alla messa a punto di tecniche atte ad estrarre e purificare tali proteine dal terreno, con lo scopo ultimo di saggiare la presenza e l'attività dell'enzima idrolitico β-glucosidasi. Questo enzima catalizza l'idrolisi del cellobiosio in glucosio (ultimo step della via catabolica della cellulosa) ed è quindi importante per il ciclo del carbonio e per la "qualità" del suolo in generale.
La metodologia utilizzata ha previsto l'estrazione delle proteine extracellulari libere e di quelle legate alla componente umica attraverso l'impiego di due estraenti. La componente microbica è stata allontanata dall'estratto attraverso filtrazione su membrana batteriologica 0,22 μm. Per favorire la rottura dei complessi formati tra proteine e sostanze umiche, l'estratto è stato sottoposto a trattamenti fisici (shock termico). In seguito è stato desalificato attraverso membrane da dialisi, e concentrato tramite ultrafiltrazione.
A questo punto per allontanare le sostanze umiche in eccesso dall'estratto è stato effettuato un passaggio di purificazione utilizzando il polimero polivinilpirrolidone. Il successivo step ha previsto la precipitazione delle proteine con il metodo che utilizza deossicolato e acido tricloroacetico (DOC-TCA).
Infine sono state applicate elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti e non denaturanti (SDS-PAGE e NATIVE-PAGE) per visualizzare le proteine estratte nella forma denaturata e nativa con lo scopo ultimo di ricercare la presenza dell'attività β-glucosidasica.