logo SBA

ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-10052007-130429


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
SPUGNESI, LAURA
URN
etd-10052007-130429
Titolo
Geni che regolano la rigenerazione dell'osso: analisi dell'espressione di Otx1 nell'osteogenesi
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Dott.ssa Magli, Maria Cristina
Parole chiave
  • cellule staminali mesenchimali (MSC)
  • osteogenesi
  • otx1
Data inizio appello
22/10/2007
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
22/10/2047
Riassunto
Molti studi avvalorano l’ipotesi che processi di differenziazione di diversi tessuti siano orchestrati da meccanismi molecolari comuni. I geni contenenti omeobox codificano fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione dello sviluppo embrionale e nel controllo di processi differenziativi adulti. Un esempio significativo è rappresentato dai geni Otx, omologhi nei Vertebrati del gene Orthodenticle di Drosophila, che svolgono un ruolo di notevole rilievo sia nella neurogenesi che nell’ematopoiesi. Otx2 è il primo a essere attivato durante l’embriogenesi ed è indispensabile per la specificazione precoce della piastra neurale. Otx1 mostra un’espressione più tardiva necessaria per l’organizzazione dell’area temporale della corteccia cerebrale ed è coinvolto anche nello sviluppo di occhio e orecchio e nella funzionalità della ghiandola pituitaria. Topi Otx1 -/- sono affetti da epilessia e mostrano varie anormalità neurologiche e difetti al sistema acustico e visivo; i topi Otx2 -/- sono invece non vitali in quanto viene completamente a mancare la formazione delle strutture anteriori del cervello.
Studi effettuati nel nostro laboratorio hanno dimostrato che Otx1 ha un’importante funzione anche nella produzione di cellule del sangue. Infatti è espresso nei precursori ematopoietici e, ad alti livelli, nei precursori eritroidi. L’ablazione di Otx1 provoca un difetto intrinseco nelle cellule staminali ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells - HSC) che ha come conseguenza una produzione insufficiente di cellule eritroidi. Otx1 contribuisce al controllo dell’eritropoiesi attraverso l’azione diretta su un fattore di trascrizione, SCL, fondamentale per l’ematopoiesi e in particolare per la filiera eritroide.
Nel midollo osseo, insieme alle HSC e ai progenitori ematopoietici, sono presenti cellule staminali e progenitori mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells o Marrow Stromal Cells - MSC) responsabili della formazione di osso, cartilagine, tessuto adiposo e tessuto muscolare.
Il nostro interesse è attualmente diretto, per diversi motivi, a comprendere se i geni Otx contribuiscano anche alla regolazione delle cellule mesenchimali:
a) le MSC rappresentano un altro tipo di cellule staminali nel quale verificare l’ipotesi per cui i geni Otx controllano proprietà comuni a tutte le cellule staminali
b) insieme agli osteoblasti maturi e alle cellule endoteliali, le MSC costituiscono la nicchia delle HSC ovvero il microambiente necessario a mantenere le loro caratteristiche staminali
c) cellule ematopoietiche e osteoblasti sembrano derivare da un precursore comune
d) i meccanismi molecolari che regolano il differenziamento e la maturazione delle MSC sono ancora poco conosciuti.
Scopo della mia tesi è determinare l’espressione dei geni Otx in cellule mesenchimali durante la loro differenziazione in senso osteogenico. Un buon modello sperimentale per questo processo è costituito dalla linea cellulare murina MC3T3-E1, ottenuta dalle ossa del cranio di embrione di topo, che riproduce il processo di differenziamento degli osteoblasti durante la formazione di osso in vivo.
Pertanto ho analizzato l’espressione dei geni Otx in cellule MC3T3-E1 mantenute in coltura, sia allo stato indifferenziato sia a tempi diversi durante la differenziazione in senso osteogenico. Ho verificato lo stadio differenziativo attraverso una colorazione istochimica (Alizarin Red) che mette in evidenza la formazione di matrice di fosfati di calcio tipica degli osteoblasti maturi e ho valutato l’espressione di geni regolatori e di marcatori osteogenici tramite PCR semiquantitativa e quantitativa (Real Time qPCR). I risultati ottenuti dimostrano che Otx1 è espresso in cellule MC3T3-E1 mentre Otx2 è inattivo. Inoltre l’espressione di Otx1 è modulata nel corso della differenziazione osteogenica. Un’analisi iniziale dei possibli targets ha evidenziato che, al contrario di quanto avviene nel sistema ematopoietico, Scl non interviene nel pathway trascrizionale di Otx1 nel sistema mesenchimale. Al fine di verificare se OTX1 potesse essere coinvolto anche nell’osteogenesi umana, ho effettuato una analisi di espressione in cellule staminali mesenchimali umane sia allo stato indifferenziato che dopo induzione in senso osteogenico. I risultati ottenuti confermano il profilo di espressione riscontrato nel modello murino. Queste osservazioni suggeriscono che Otx1 sia implicato nel controllo della rigenerazione ossea confermando l’ipotesi di una sua funzione regolatrice in diversi processi differenziativi.
File