ETD

• atassia teleangectasia
• ataxia telangiectasia
• ATG4
• ATM
• autophagy
• crispr/Cas9
• KU-55933
• zebrafish

Ataxia Telangiectasia (A-T) is a rare autosomal recessive disorder characterized by cerebellar ataxia, telangiectasia, immunodeficiency, cancer predisposition, and radiosensitivity. It is caused by mutations in the ATM gene, encoding a kinase essential for the DNA damage response (DDR). Beyond its canonical role in DNA double-strand break repair, ATM also regulates oxidative stress and autophagy, processes relevant to A-T neurodegeneration. This thesis investigated the loss of function of the zebrafish atm gene as an in vivo model, focusing on its role in autophagy regulation and in the response to genotoxic stress. Loss of function in ATM orthologue was induced through CRISPR/Cas9-generated crispants and pharmacological approach by exposure to kinase inhibitor KU-55933. Embryonic and larval phenotypes were assessed through behavioral and stress-response assays. Crispants exhibited early hyperlocomotion at 24 (hours post-fertilization) hpf, followed at larval stages by hypoactivity and disrupted light/dark rhythms. In contrast, KU-55933-treated embryos did not showed early alterations but developed hyperlocomotion at later stages, highlighting different outcomes between genetic and pharmacological approaches. Upon ultraviolet B (UV-B) irradiation, a dose-dependent increase in morphological damage was observed, with greater sensitivity in crispants. Western blot analysis of DNA damage-associated histone variant γ-H2AX in wild-type embryos revealed increased expression after UV-B exposure, indicating DDR activation.
Together, these findings establish zebrafish as a valuable model for dissecting ATM-dependent mechanisms and provide reproducible functional readouts suitable for high-throughput screening of small molecules, particularly autophagy modulators, with potential therapeutic relevance for A-T.

L’Atassia-Teleangectasia (A-T) è una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata da atassia cerebellare, teleangectasie, immunodeficienza, predisposizione tumorale e radiosensibilità. È causata da mutazioni nel gene ATM, che codifica per una chinasi essenziale nella risposta al danno al DNA (DDR). Oltre al ruolo canonico nella riparazione delle rotture a doppio filamento, ATM partecipa anche alla regolazione dello stress ossidativo e dell’autofagia, processi rilevanti per la neurodegenerazione tipica dell’A-T.
In questo progetto di tesi lo zebrafish è stato impiegato come modello in vivo per analizzare la perdita di funzione di atm, con particolare attenzione al suo coinvolgimento nella regolazione dell’autofagia e nella risposta allo stress genotossico. Per indurre la perdita di funzione sono stati adottati due approcci complementari: la generazione di crispanti tramite CRISPR/Cas9 e l’inibizione farmacologica con l'inibitore chinasico KU-55933. L’analisi fenotipica di embrioni e larve a differenti stadi di sviluppo ha rivelato un’iperlocomozione precoce nei crispanti (24 hpf), seguita in fase larvale da ipoattività e da un’alterata modulazione luce/buio. Gli embrioni trattati con KU-55933, invece, non mostravano difetti iniziali ma sviluppavano iperlocomozione a stadi larvali, mettendo in evidenza differenze tra approccio genetico e farmacologico. Dopo irraggiamento con raggi ultravioletti di tipo B (UV-B) è stato osservato un incremento dose-dipendente dei danni morfologici, con maggiore sensibilità mostrata dai crispanti. L’analisi Western blot dei livelli della variante istonica associata a stress γ-H2AX, eseguita finora solo in embrioni wild-type, ha mostrato un aumento dopo l’esposizione, indicando attivazione della DDR.
Nel complesso, questi risultati confermano lo zebrafish come modello utile per lo studio dei meccanismi ATM-dipendenti e forniscono readout funzionali riproducibili, utili per screening di piccole molecole, in particolare modulatori dell’autofagia, con potenziali ricadute terapeutiche per l’A-T.