ETD

• ADCC
• Antibody
• COVID-19
• IgG glycosilation
• Inflammation based disorders
• VIIT

La glicosilazione delle Immunoglobuline G (IgG) a livello del residuo di asparagina 297 (Asn 297) localizzato nel dominio CH2 del frammento Fc, regola l’interazione tra Fc e i relativi recettori (FcγR). Tale interazione modula la risposta immunitaria umorale mediata dalle cellule effettrici, inclusa la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC). Il core oligosaccaridico conservato è costituito da residui di N-acetilglucosamina e mannosio, ai quali possono essere aggiunti in modo variabile altri monosaccaridi, tra cui fucosio, galattosio e acido sialico. In particolare, l’assenza del residuo di fucosio (afucosilazione) è associata a un’aumentata attività pro-infiammatoria, potenziando la risposta ADCC attraverso un incremento dell’affinità per i recettori FcγRIIA/IIIA. Una maggiore percentuale di IgG afucosilate è stata riscontrata in pazienti con forme gravi di infezioni virali. In particolare, nei casi critici di COVID-19 è stata osservata una marcata produzione di IgG specifiche per la proteina Spike con un basso grado di fucosilazione. La produzione di IgG afucosilate può verificarsi anche in seguito alla somministrazione di vaccini a vettore virale ricombinante, come Vaxzevira AZD1222 (AstraZeneca; 2020), i quali inducono l’espressione della proteina Spike in una conformazione strutturale simile a quella della proteina nativa di SARS-CoV-2. Questo elevato grado di somiglianza antigenica potrebbe favorire l’attivazione di risposte ADCC aberranti, contribuendo all’instaurarsi di un’eccessiva risposta infiammatoria sistemica. Obiettivo del presente studio è l’ottimizzazione di un metodo di screening in grado di rilevare variazioni nel grado di fucosilazione delle IgG sieriche, mediante l’impiego della lectina Aleuria aurantia (AAL) marcata con fluoresceina, che riconosce preferenzialmente il fucosio legato al primo residuo di N-acetilglucosamina (α-1,6). Le IgG sono state purificate da aliquote residuali di siero di soggetti anonimi vaccinati con sono Vaxzevira AZD1222, mediante biglie magnetiche funzionalizzate con proteina G. Successivamente, le IgG specifiche anti-Spike sono state isolate tramite micropiastre rivestite con proteina S. I campioni ottenuti sono stati sottoposti ad analisi mediante 10% SDS-PAGE riducente e successivo Western blot con lectina AAL. Come controllo negativo, i campioni sono stati deglicosilati con PNGase F, un’amidasi che rimuove completamente le catene N-glicosidiche. Come controllo positivo, i campioni sono stati trattati con Endo S, un’endoglicosidasi che rimuove la catena glicosidica conservando il primo residuo di N-acetilglucosamina e il relativo fucosio eventualmente presente. Il medesimo protocollo è stato applicato a un’aliquota residuale di siero appartenente a un paziente anonimizzato affetto da trombocitopenia trombotica immune indotta da vaccino (VITT) in seguito alla vaccinazione con sono Vaxzevira AZD1222, al fine di valutare il grado di fucosilazione in questa specifica condizione patologica.

Glycosylation of Immunoglobulin G (IgG) at the asparagine 297 (Asn 297) residue, located within the CH2 domain of the Fc fragment, regulates the interaction between Fc and its receptors (FcγR). This interaction modulates the humoral immune response mediated by effector cells, including antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
The conserved core oligosaccharide consists of N-acetylglucosamine and mannose residues, to which additional monosaccharides, such as fucose, galactose, and sialic acid, can be attached. Notably, the absence of fucose (afucosylation) is associated with enhanced pro-inflammatory activity, as it increases the binding affinity to FcγRIIA/IIIA and thereby strengthens ADCC responses. Elevated levels of afucosylated IgG have been reported in patients with severe viral infections. In particular, severe cases of COVID-19 have been associated with a marked production of Spike-specific IgG characterized by low fucosylation levels. Afucosylated IgG can also be generated following administration of recombinant viral vector vaccines, such as ChAdOx1 nCoV-19 (AstraZeneca), which induce the expression of the SARS-CoV-2 Spike protein in a native-like structural conformation.This high antigenic similarity may promote aberrant ADCC responses, contributing to excessive systemic inflammation.
The aim of this study was to optimize a screening method to detect variations in the fucosylation degree of serum IgG, using fluorescein-labeled Aleuria aurantia lectin (AAL), which preferentially recognizes fucose linked to the first N-acetylglucosamine residue (α-1,6). IgG were purified from residual serum samples of anonymized subjects vaccinated with Vaxzevria AZD1222 (AstraZeneca; 2020) using protein G–functionalized magnetic beads. Subsequently, Spike-specific IgG were isolated by protein S coated microplates. Samples were analyzed by 10% reducing SDS-PAGE followed by Western blot with AAL lectin. As negative control, samples were deglycosylated with PNGase F, an amidase that completely removes N-glycan chains. As a positive control, samples were treated with Endo S, an endoglycosidase that cleaves the glycan chain while leaving the innermost N-acetylglucosamine residue and any attached fucose intact. The same protocol was applied to a residual serum sample from an anonymized patient diagnosed with vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) after Vaxzevria AZD1222 vaccination to assess IgG fucosylation in this specific pathological condition.