• DOTAGA
• Fn3
• mesotelina
• Mesotelioma pleurico
• mesothelin
• pleural mesothelioma
• radionuclide
• target therapy
• terapia a bersaglio molecolare

INGEGNERIZZAZIONE E BIOCONIUGAZIONE DI VARIANTI DI Fn3 AFFINI ALLA MESOTELINA COME AGENTE TERAPEUTICO CONTRO IL MESOTELIOMA PLEURICO
Il mesotelioma pleurico (MP) è un tumore che ha origine dalle cellule mesoteliali della pleura, una membrana sierosa che riveste i polmoni. Circa l’80% dei casi di MP è riconducibile ad un’esposizione pregressa alle fibre di amianto, le quali possono essere inalate depositandosi a livello polmonare. La mesotelina (MSLN) è una glicoproteina di membrana sovraespressa in molti tumori, tra cui MP. Pertanto, molecole progettate per poter legare specificamente la MSLN possiedono un notevole potenziale terapeutico e diagnostico. Terapie basate su anticorpi che hanno come bersaglio la MSLN sono state ampiamente utilizzate a scopo di ricerca e in trial clinici, ma la loro efficienza è ridotta probabilmente a causa del peso molecolare degli anticorpi (~140 kDa). A tal proposito, sono state proposte diverse alternative, tra cui una struttura con una organizzazione simil-immunoglobulinica derivante dal decimo dominio della fibronectina di tipo III umana (Fn3, ~13 kDa) utile per terapie su base molecolare e ingegnerizzata per riconoscere la MSLN. In studi precedenti, è stato dimostrato come una variante di Fn3 fosse in grado di legare con elevata affinità la MSLN in una linea cellulare di MP. Per le sue proprietà, Fn3 risulta promettente come trasportatore di radionuclidi contro il MP. In particolare, nel corso della tesi, è stata utilizzata la variante di Fn3 con l’obiettivo di ottimizzarne la coniugazione con il chelante DOTAGA, per una futura radioconiugazione, mantenendo invariata l’affinità del legame Fn3-MSLN. La variante di Fn3 è stata prodotta su larga scala utilizzando cellule di E. coli BL21 (DE) e purificata tramite cromatografia per affinità. La coniugazione è stata effettuata testando differenti protocolli, variando il buffer, il pH ed il rapporto molare Fn3-DOTAGA. Tramite citofluorimetria, è stata valutata l’affinità di Fn3-DOTAGA alla MSLN, stimando la costante di dissociazione all’equilibrio (KD). Dalle analisi di spettrometria di massa è emerso che tale variante di Fn3 risultava funzionalizzata con più molecole di DOTAGA. Tale condizione non è ideale in vista di una futura radioconiugazione, in quanto non garantisce una riproducibilità sperimentale. Quindi, in modo da ottenere un singolo sito per la bioconiugazione con DOTAGA, è in corso l’ottimizzazione di un protocollo di clonaggio molecolare per ottenere una nuova variante di Fn3.

ENGINEERING AND BIOCONJUGATION OF Fn3 VARIANTS RELATED TO MESOTHELIN AS A THERAPEUTIC AGENT AGAINST PLEURAL MESOTHELIOMA
Pleural mesothelioma (PM) is a tumor that originates from mesothelial cells of the pleura, a serous membrane lining the lungs. About 80% of PM cases are due to a previous exposure to asbestos fibres, that can be inhaled and deposited in the lungs. Mesothelin (MSLN) is a membrane glycoprotein overexpressed in many tumors, including PM. Therefore, molecules designed to bind specifically MSLN have significant therapeutic and diagnostic potential. Antibodies based therapy targeting MSLN were widely used in research and in clinical trials, but their efficiency is reduced probably because of the molecular weight of the antibodies (~140 kDa). In this regard, differences alternatives have been proposed, including an immunoglobulin-like structure derived from the tenth domain of human type III fibronectin (Fn3, ~13 kDa), useful for molecular based therapies and engineered to recognize MSLN. In previous studies, it has been demonstrated that a Fn3 variant was able to bind MSLN with high affinity in an PM cell line. For its properties, Fn3 shows promise as a transporter of radionuclides against MP. Particularly, in this thesis, the variant of Fn3 was used with the aim of optimizing its conjugation with the chelator DOTAGA, for future radio-conjugation, while keeping the affinity of Fn3-MSLN binding unchanged. The Fn3 variant was produced on a large-scale using E. coli BL21 (DE) cells and purified by affinity chromatography. The conjugation was performed testing different protocols, changing the buffer, the pH and the molar ratio Fn3-DOTAGA. Through cytofluorimetry, the affinity of Fn3-DOTAGA to MSLN was assessed by estimating the dissociation constant at equilibrium (KD). Mass spectrometry analyses showed that this variant of Fn3 was functionalized with multiple molecules of DOTAGA. This condition is not ideal in view of future radio-conjugation because does not ensure experimental reproducibility. Therefore, to obtain a single site for bioconjugation with DOTAGA, optimization of a molecular cloning protocol to obtain a new variant of Fn3 is underway.