• antioxidant responsive elements
• cultured hepatocytes
• difese endogene
• endogenous defenses
• epatociti in coltura
• fitochimici
• phytochemicals
• reactive oxygen species
• specie reattive dell'ossigeno
• unfolded protein response

Numerosi studi dimostrano che diete ricche di alimenti di origine vegetale contribuiscono a prevenire parte delle malattie cardio-vascolari e diverse forme di tumore.
In particolare in alcuni recenti studi sono stati resi noti gli effetti positivi dei legumi nel migliorare il profilo lipidico del siero in pazienti con malattie cardiovascolari o con diabete di tipo II.
Inoltre, è stato riportato che le abbondanti proteine, le saponine e le componenti fenoliche presenti nei fagioli sono ingredienti attivi responsabili di benefici associati al consumo di tale legume. Una delle proprietà biologiche che rendono il fagiolo un alimento utile per il nostro organismo è la sua capacità antiossidante.
Lo scopo di questa tesi è quello di investigare la capacità protettiva di un lisato di fagiolo in seguito a stress ossidativo, indotto da trattamento con acqua ossigenata in epatociti primari di ratto.
Gli epatociti, estratti seguendo il metodo De Smet, sono stati fatti crescere in un doppio strato di collagene: questo modello, detto a “sandwich”, rappresenta il modo migliore per riprodurre le condizioni delle cellule in vivo, ossia la loro caratteristica forma e le connessioni cellula-cellula e cellula-matrice. Dopo 24 h di crescita gli epatociti sono stati trattati in diversi modi: un gruppo di controllo; un gruppo trattato con H2O2 200 µM per indurre stress; un gruppo trattato con il lisato di fagiolo alla concentrazione di 0,7 mg/ml ed infine un altro gruppo, per il quale abbiamo effettuato un pretrattamento con la sostanza in esame, sempre alla stessa concentrazione, seguito dal trattamento con H2O2.
Come indice dello stress ossidativo indotto dal trattamento con H2O2 è stata stimata la concentrazione di malonildialdeide tramite la misurazione dei TBARS e per avere una stima della percentuale di lisi cellulare è stato misurato il rilascio dalle cellule dell’enzima lattato deidrogenasi. Per testare la capacità del lisato di indurre il sistema antiossidante abbiamo preso in considerazione due enzimi markers, la DT-diaforasi e l’eme ossigenasi-1 e ne abbiamo valutato l’induzione al livello trascrizionale e catalitico. Sono stati inoltre misurati i livelli proteici di eme ossigenasi-1, per avere un’ulteriore conferma a sostegno della nostra ipotesi. E’ stato poi effettuato il dosaggio del glutatione cellulare e mitocondriale e si è eseguita una PCR quantitativa per valutare l’espressione dei geni codificanti per le due subunità (C ed M) della glutammato cisteina ligasi, l’enzima che catalizza la prima tappa della sintesi del glutatione.
Per confermare l’attivazione della via di trasduzione del segnale che porta all’attivazione del sistema di difesa antiossidante, sono stati estratti i nuclei per l’esecuzione di un immunoblotting per la proteina Nrf2.
I risultati ottenuti hanno confermato quanto atteso, infatti il trattamento degli epatociti con H2O2 200 µM ha efficientemente provocato un danno ossidativo, in quanto la concentrazione di malonildialdeide e la percentuale di lisi cellulare si sono dimostrate significativamente aumentate. Il pretrattamento con lisato per 1h, prima della somministrazione di H2O2, ha invece contribuito ad una diminuzione di entrambi i parametri.
Per quanto riguarda gli enzimi DT-diaforasi ed eme-ossigenasi si è riscontrata una diminuzione rispetto al controllo sia della quantità di trascritto dei geni, sia della loro attività enzimatica, nelle cellule trattate con H2O2. Al contrario, nel gruppo trattato con lisato di fagiolo si è avuto un aumento della quantità di trascritto e di attività catalitica dei suddetti enzimi. Inoltre, nelle cellule pretrattate con lisato per 1 ora e successivamente trattate con H2O2, si è osservato un aumento trascrizionale e catalitico di tali enzimi rispetto al gruppo trattato con sola H2O2, a dimostrazione dell’effetto protettivo del lisato dal danno sugli epatociti.
Risultati analoghi sono stati ottenuti anche il relazione al dosaggio del glutatione nella sua forma ridotta e dell’enzima che lo sintetizza, la glutammato cisteina ligasi.
L’immunoblotting per il fattore di trascrizione Nrf2 riporta una diminuzione dell’intensità della banda rispetto al controllo nel gruppo di cellule trattate con H2O2 ; l’intensità della banda di Nrf2 negli epatociti trattati con il lisato di fagiolo e in quelli trattati con lisato prima di indurre lo stress, aumenta invece rispetto al controllo, a dimostrazione dell’attivazione della via di trasduzione del segnale in cui è coinvolto Nrf2.
La seconda parte del lavoro è stata finalizzata alla valutazione dell’effetto protettivo del lisato di fagiolo nei confronti dello stress del reticolo endoplasmatico indotto da stress ossidativo. A tale scopo sono stati eseguiti immunoblotting per GRP78, GADD153 e caspasi12, tre markers dello stress del reticolo endoplasmatico.
I risultati hanno mostrato che i livelli di tali proteine sono aumentati significativamente rispetto al controllo nei gruppi trattati con H2O2, in modo analogo a quanto riscontrato trattando le cellule con la tunicamicina, un induttore dello stress del reticolo endoplasmatico, noto in letteratura. Nel gruppo di epatociti trattati con lisato di fagiolo si è invece osservata una diminuzione dei livelli proteici; una diminuzione, anche se di minore entità, si è avuta anche nel gruppo di cellule pretrattate con lisato e poi trattate con H2O2.
Questi dati hanno confermato un effetto protettivo del lisato di fagiolo dallo stress ossidativo e da quello del reticolo endoplasmatico.