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Le infezioni opportunistiche di natura fungina costituiscono un problema di rilevante importanza medica, risultando tra le principali cause di mortalità nonché di morbidità negli individui immunocompromessi.
Nonostante numerosi studi abbiano contribuito ad approfondire le attuali conoscenze sulle infezioni fungine, la diagnosi di queste ultime è attualmente basata sull’isolamento colturale e successiva identificazione mediante analisi delle caratteristiche macro e microscopiche della colonia, del profilo biochimico e sull’analisi morfologica delle strutture riproduttive. Tali metodi richiedono lunghi tempi di esecuzione e non sempre permettono, per le specie di recente definizione, una accurata discriminazione. Pertanto, è molto sentita l’esigenza di allestire nuove strategie di identificazione per una rapida diagnosi delle infezioni micotiche.
In tale ottica, in questo lavoro di tesi, è stato allestito un pannello di identificazione su vetrino (micro-array) per la diagnostica molecolare dei principali miceti patogeni per l’uomo, basato sull’impiego di sonde molecolari specie-specifiche, complementari a regioni conservate nel genoma di ciascuna specie fungina in esame (regione ITS1-rRNA 5,8S –ITS2).
Questo sistema prevede l’estrazione del DNA genomico, l’amplificazione della regione ITS e successiva ibridazione del prodotto di PCR sul vetrino contenente sonde specifiche costruite sulla regione ITS. Il sistema di rilevazione del segnale è basato sulla nuova tecnica molecolare, denominata APEX (arrayed primer extension), che prevede che ogni frammento ibridi specificamente con l’oligonucleotide complementare spottato sul vetrino in posizione nota e che la DNA polimerasi estenda la base complementare immediatamente successiva in posizione 3’. L’estensione si arresta immediatamente in quanto la base incorporata è un terminatore che reca un fluorocromo specifico, per cui la lettura della fluorescenza emessa da ogni spot indicherà l’avvenuta ibridazione del frammento con la sonda e, quindi, la corretta identificazione del microorganismo.
Per la messa a punto della metodica sono stati utilizzati ceppi di riferimento e isolati clinici di 24 specie di lieviti, tra i quali Candida albicans, Candida spp., Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae, e di ifomiceti come Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Microsporum canis, Trichosporon cutaneum.
In conclusione, questo lavoro di tesi ha permesso di dimostrare l’utilità dell’ applicazione della metodologia APEX alla diagnostica dei funghi patogeni, consentendo una inequivocabile discriminazione anche di specie correlate molto vicine geneticamente, come C. albicans e C. dubliniensis o C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis, o come A. fumigatus e A. terreus. I dati ottenuti indicano che questo sistema consente un’identificazione non soggettiva, rapida, estremamente sensibile e specifica di varie specie fungine, risultando di potenziale applicazione direttamente su materiale clinico.