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La zinc finger protein 865 (ZNF865) è una proteina zinc finger appartenente alla famiglia delle C2H2,
codificata dal gene ZNF865 localizzato a livello del cromosoma 19, costituito da un singolo esone codificante di 3763 bp (NM_001195605).
La proteina è costituita da 1059 Aa e risulta non essere ancora caratterizzata a livello funzionale, si tratta di una proteina di legame al DNA tramite il dominio Cys2His2 e potrebbe essere coinvolta nella regolazione trascrizionale, della senescenza cellulare, della progressione del ciclo cellulare e nel processamento delle proteine.
Infatti, le proteine zinc finger risultano essere il gruppo maggiormente espresso tra le proteine regolatrici, nonostante le funzioni della maggior parte restino ancora sconosciute.
Il gruppo di ricerca di un nostro collaboratore ha caratterizzato 6 individui non imparentati tra loro in cui sono state caratterizzate 5 mutazioni de novo in ZNF865.
Questi individui presentano segni clinici quali, ritardo globale di sviluppo, disabilità intellettiva, ritardo del linguaggio, ipotonia, dismorfismo craniofacciale, difficoltà di nutrizione, autismo, epilessia, scoliosi.
Si tratta di mutazioni che sono associate a delle sindromi a cui non è ancora associato un nome e che si presume siano dovute ad un loss-of-function della proteina.
Il mio progetto di tesi si propone di ampliare le conoscenze relative alla proteina ZNF865 tramite degli studi in vivo, utilizzando l’organismo Danio Rerio in quanto il gene che codifica per la proteina ZNF865 risulta avere la stessa localizzazione a livello del cromosoma 19 e risulta avere la stessa struttura costituita da un singolo esone codificante, presumendo che si tratti di un omologo del gene umano avendo questa caratteristica comune.
Essendo un gene di cui non si hanno molte informazioni, ho effettuato un pattern di espressione, sia qualitativo che quantitativo.
Per il pattern di espressione qualitativo, ho generato una sonda legata alla digossigenina, utilizzata per le ibridazioni in situ sia whole mount che su sezione per analizzare la localizzazione dell’espressione di ZNF865.
Per quanto riguarda il pattern di espressione quantitativa, ho utilizzato la tecnica di qPCR per effettuare una misurazione dell’espressione del gene nei vari stadi di sviluppo dell’organismo modello e valutarne i livelli di espressione genica ai vari stadi e poter identificare la tipologia di gene.
Ulteriore obiettivo è di effettuare degli studi funzionali in vivo tramite l’utilizzo del sistema Crispr/Cas13.
Ho effettuato delle microiniezioni del sistema Crispr/Cas13 allo stadio di una cellula in embrioni wild type per andare a generare una eliminazione degli RNA trascritti dal gene di ZNF865, che andrà a mimare la loss-of-function che si presume essere alla base delle manifestazioni cliniche dei pazienti. Si tratta di microiniezioni di guide specifiche per zone a bassa energia libera del gene codificante, che andranno a legarsi a zone del trascritto per effettuare un taglio tramite la Cas13, che promuoverà la degradazione del trascritto stesso, andando a generare un abbattimento del trascritto.
Gli embrioni sono stati fatti sviluppare fino ad arrivare allo stadio di 5dpf, che è lo stadio in cui sono presenti le cartilagini embrionali, sono stati fissati in paraformaldeide, per effettuare una colorazione Alcian Blue, ovvero un colorante che va a legarsi a livello delle cartilagini per poter effettuare una analisi morfologica e verificare che la perdita di funzione di ZNF865 provoca dei fenotipi che rispecchiano le alterazioni craniofacciali presenti nei pazienti e che questi embrioni abbiano delle alterazioni a livello osseo che possano rispecchiare la scoliosi presente nei pazienti.
È importante effettuare questi studi per la caratterizzazione di questo gene, per verificare che Danio Rerio sia un buon organismo modello per indagare le sindromi associate alle mutazioni di ZNF865, in modo da poterlo utilizzare per lo studio approfondito, caratterizzare l’andamento del quadro clinico e, in futuro, poterli utilizzare per testare nuove terapie.

Zinc finger protein 865 (ZNF865) is a zinc finger protein belonging to the C2H2 type family, coded by gene ZNF865 localized on the chromosome 19, constituted by 3763bp single coding exon (NM_001195605).
The protein is constituted by 1059 Aa e it’s still not characterized functionally, but it’s a DNA binding protein thanks to the Cys2His2 domain e it could be involved in transcription regulation, cellular senescence, cell cycle progression and protein processing.
In fact, zinc finger proteins are the most expressed regulatory proteins, despite the functions are still unknown for most of them.
Our collaborator’s research group identified 6 unrelated individuals in which characterized 5 de novo mutation in ZNF865.
These individuals show clinical signs, global developmental delay intellectual disability, language delay, hypotonia, craniofacial dysmorphism, nutritional difficulties, autism, epilepsy and scoliosis.
Those are mutation associated with an orphan disease, which is assumed to be associated with a loss-of-function of the protein.
The aim of my project is to extend the ZNF865 protein information using in vivo study, using Danio rerio as a model organism because the coding gene of ZNF865 has the same localization on the chromosome 19 and it has the same structure consisting of a single coding exon, presuming that it’s the homologues of the human gene.
Since we don’t have information about this gene, I have realized an expression pattern, both qualitative and quantitative.
To obtain the qualitative expression pattern, I generated a digoxigenin-labeled probe, used for both whole mount and cryosection in situ hybridization to analyze ZNF865 expression.
Regarding the quantitative expression pattern, I used qPCR technique to measure the gene expression during different model organism’s development stages to identify gene type.
Further goal is to analyze functional studies in vivo using CRISPR/Cas13 technique. I’ve started to microinject system CRISPR/Cas13 inside one cell stage wild-type embryos to generate ZNF865’s mRNA elimination, to mimic the loss-of-function presumed to be responsible of the patients’ clinical manifestations. This technique is about microinjections of RNA guide specific for low energy areas of ZNF865 areas, that are going to bind to the transcript to make a cut using the Cas13, to promote the degradation of the mRNA, generating a transcript knock-down.
The embryos developed until 5dpf stage, when the embryonal cartilage is present, fixed in paraformaldehyde, for then effectuate histologic coloration Alcian Blue, staining specific for cartilage to make a morphological analysis and verify if the ZNF865 loss-of-function cause morphological phenotype that reflect both the craniofacial and bones alteration in patients.
These studies are important for the characterization of this gene, to verify if Danio rerio is an ideal organism model to investigate the syndrome associate to the ZNF865 mutations, to use it for in-depth studies, for the characterization of the clinical development and, in future, to use it for drug trials for new therapies.