ETD

• A549 cells
• apoptosi
• Arthrospira platensis
• infiammazione
• NSCLC
• polysaccharides
• stress ossidativo

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta circa l’85% di tutti i tumori polmonari e costituisce la principale causa di morte oncologica a livello globale. La prognosi sfavorevole della malattia è attribuibile, in larga misura, alla diagnosi tardiva e alla sua elevata aggressività biologica. Diversi fattori di rischio come fumo di tabacco, esposizioni ambientali e professionali, inquinamento atmosferico, patologie polmonari pregresse e predisposizione genetica, contribuiscono in modo sinergico all’eziopatogenesi del tumore.
Da un punto di vista terapeutico, per i pazienti con NSCLC in stadio iniziale il trattamento prevede la combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia; tuttavia, tali strategie si sono dimostrate spesso inefficaci nei pazienti con malattia in fase avanzata, i quali presentano un elevato tasso di recidiva e metastatizzazione. Negli ultimi anni, l’approccio terapeutico al NSCLC avanzato ha subito un’evoluzione significativa. Attualmente, infatti, il consenso medico si orienta verso un approccio terapeutico personalizzato, fondato sull’individuazione e l’inibizione di alterazioni genetiche e proteiche, specifiche delle cellule tumorali, coinvolte nella capacità proliferativa e di sopravvivenza delle cellule tumorali stesse. Ad oggi, sono stati sviluppati e approvati numerosi trattamenti di terapia mirata, come ad esempio alcuni inibitori delle tirosin chinasi (TKI) diretti contro alterazioni geniche di marcatori molecolari del tumore, quali EGFR, ALK, ROS1 e KRAS, che hanno contribuito a migliorare in maniera significativa la sopravvivenza e la qualità della vita nei pazienti affetti da tale patologia.
In parallelo, i prodotti naturali continuano a rappresentare una risorsa fondamentale nello sviluppo di nuovi farmaci, in particolare in ambito oncologico, con circa l’80% degli agenti chemioterapici derivanti da sostanze naturali. Nell’ambito dei prodotti naturali, i composti di origine marina stanno emergendo come promettenti fonti di nuove molecole, appartenenti alle famiglie dei polisaccaridi, polifenoli, alcaloidi e peptidi, per le quali sono state evidenziate promettenti attività inibenti la crescita e la proliferazione di numerose linee cellulari tumorali.
Nel corso del mio progetto di tesi, mi sono occupata dell’estrazione e purificazione di polisaccaridi da Arthrospira platensis al fine di valutarne la potenziale attività antitumorale in un modello in vitro di NSCLC.
L’estrazione è stata eseguita presso il Dipartimento di Farmacia mediante un protocollo che prevede l’utilizzo combinato di acqua calda ed ultrasuoni, seguita da un processo di purificazione (deproteinizzazione e decolorazione) con papaina, acido tricloroacetico (TCA) e perossido di idrogeno, secondo le modalità descritte da W. Cheng et al. (2018), di ampio utilizzo e validazione nel laboratorio dove ho condotto parte dei miei studi di tesi.
L’estratto purificato, particolarmente ricco in polisaccaridi, denominato SSG8, è stato successivamente testato in vitro, presso il laboratorio di Biochimica del Dipartimento di Patologia CMMAC, utilizzando come modello sperimentale una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano non a piccole cellule, denominata A549. Gli esperimenti da me condotti hanno incluso per primo la valutazione dell’effetto citotossico di SSG8 mediante test MTT, e l’individuazione di dosi idonee per i successivi esperimenti, rivolti alla valutazione dei potenziali effetti antitumorali di SSG8, quali l’induzione di una risposta pro-infiammatoria di tipo acuto e immunostimolante, di stress ossidativo e apoptosi. I risultati di esperimenti dose-risposta hanno evidenziato che in cellule A549 il trattamento con SSG8 (1-400 g/mL) per 24h era in grado di produrre, in maniera dose dipendente, una significativa riduzione della vitalità cellulare e un marcato effetto pro-apoptotico (IC50=250 µg/mL). Inoltre, nelle cellule A549 trattate per 24 h con SSG8 alla dose massima non citotossica (150 µg/mL) è stato osservato, mediante test ELISA, un significativo aumento del rilascio di TNF, IL6 e IL21, evidenziando un marcato effetto pro-infiammatorio e immunostimolante. L’utilizzo di SSG8 alla dose citotossica (250 µg/mL), in grado di produrre una diminuzione del 50% della vitalità cellulare, è risultato indurre nelle A549 un ulteriore incremento dell’effetto pro-infiammatorio. L’attività pro-infiammatoria e pro-apoptotica di SSG8 è stata confermata da studi di analisi dell’espressione genica, che hanno evidenziato sia una modulazione di marker dell’apoptosi (BAX, BCL2 e SURVIVIN) che dell’infiammazione (COX2, ACE2, TNF, IL6 e NF-kB), rispettivamente.
Al fine di valutare la selettività e la sicurezza per una potenziale applicazione terapeutica di SSG8, in parallelo ai test condotti su A549, sono stati anche condotti studi su una linea sana di cellule bronchiali umane, quali le 16HBE. L’esposizione di cellule 16HBE al trattamento con SSG8 ha evidenziato assenza di citotossicità e mancata risposta pro-infiammatoria, suggerendone una promettente selettività d’azione nei confronti di cellule tumorali.
Infine, è stata esplorata la possibile sinergia terapeutica dell’estratto SSG8 in combinazione con Gefitinib, un inibitore della tirosin-chinasi del recettore per l’EGFR, comunemente impiegato nel trattamento del NSCLC. In cellule A549, la co-somministrazione di SSG8 (150 g/mL) a dosi crescenti di Gefitib (1-100 µM), ha mostrato indurre un incremento della citotossicità prodotta dal farmaco, suggerendo, almeno a livello preliminare, un possibile effetto sinergico in grado di migliorarne l’efficacia terapeutica.
I dati complessivamente ottenuti indicano che SSG8 presenta un potenziale terapeutico promettente; tuttavia, saranno necessari ulteriori studi per approfondire i meccanismi d’azione coinvolti e confermarne l’efficacia terapeutica.