ETD

• aldose reductase
• aldose reductase inhibitors
• aldoso reduttasi
• cristallogenesi
• cristallografia
• cristallografia a raggi x
• protein cristallography
• transthyretin
• transtiretina
• ttr
• ttr stabilizers
• x ray cristallography

L’Aldoso Reduttasi (AR) è una reduttasi NADPH dipendente, responsabile della conversione di glucosio in sorbitolo, nella prima tappa della via dei polioli. Visto il suo ruolo nella produzione di sorbitolo, e considerate le evidenze sperimentali di come una iperproduzione di sorbitolo abbia un ruolo fondamentale nello sviluppo di co-morbidità associate alla patologia diabetica, si è resa interessante la ricerca di inibitori nei confronti dell’enzima AR, al fine di trattare le co-morbidità associate al diabete.
Nel contesto di uno studio “structure based drug design”, che porti a ottenere inibitori altamente selettivi e potenti, è necessario avere un’idea chiara della struttura tridimensionale della proteina in complesso con le piccole molecole identificate come capaci di legare il sito attivo. Questo per identificare le interazioni proteina-ligando fondamentali per l'interazione con il sito attivo. Tramite la cristallografia a raggi X è possibile ottenere la struttura tridimensionale della proteina, che può essere usata per studi in silico di nuovi potenziali inibitori, rendendo più accurato il processo di ricerca.
Tramite un approccio di reverse screening è stato possibile creare un protocollo per ottenere cristalli di AR in modo efficace e riproducibile.
La transtiretina (TTR), nota anche con il nome di prealbumina, è una proteina prodotta principalmente dal fegato, e fa da trasportatore plasmatico di tiroxina e retinolo, veicolando entrambi sia nel sangue che nel liquido cefalorachidiano.
Oltre a essere un marker interessante per valutare lo stato nutritivo del paziente, la TTR assume un importante ruolo nell’amiloidosi ereditaria. L’amiloidosi ereditaria è una malattia genetica rara con esordio in età adulta. Le manifestazioni possono essere di vario tipo e possono precedere la malattia anche di diversi anni. La patologia può interessare il sistema nervoso periferico, determinando una polineuropatia assonale sensitivo-motoria simmetrica. Il danno inizia dalle fibre di diametro minore, e si sposta progressivamente a quelle di diametro maggiore, portando progressivamente alla perdita della capacità di deambulare. È possibile inoltre avere anche una manifestazione a livello cardiaco (può presentarsi sia solo a livello cardiaco, sia in congiunzione con le manifestazioni a livello del sistema nervoso periferico). Da questo la necessità di trovare molecole che siano in grado di legare le tasche della TTR contribuendo alla stabilizzazione della sua struttura tetramerica e contrastando la formazione delle fibrille amiloidi. A partire da un protocollo di cristallizzazione già esistente, in questo progetto di tesi è stato possibile ottenere cristalli di TTR Wild Type in complesso con piccole molecole stabilizzatrici sintetizzate dal gruppo di ricerca in cui ho svolto la mia tesi di laurea. Dall’analisi dei cristalli ottenuti è stato possibile studiare l’interazione TTR-ligando, ottenendo così informazioni utili per progettare molecole potenzialmente più affini ai siti di legame.

Aldose Reductase (AR) is an NADPH-dependent reductase responsible for the conversion of glucose into sorbitol, in the first step of the polyol pathway. Given its role in sorbitol production, and considering experimental evidence showing how sorbitol overproduction plays a key role in the development of comorbidities associated with diabetes, the search for inhibitors of AR has become of interest, with the aim of treating diabetes-related comorbidities.

In the context of a structure-based drug design study, aimed at obtaining highly selective and potent inhibitors, it is necessary to have a clear understanding of the three-dimensional structure of the protein in complex with small molecules identified as capable of binding the active site. This is essential to identify key protein–ligand interactions required for active site binding. Through X-ray crystallography, it is possible to determine the three-dimensional structure of the protein, which can be used for in silico studies of new potential inhibitors, making the research process more accurate.

Through a reverse screening approach, it was possible to establish a protocol to obtain AR crystals effectively and reproducibly.

Transthyretin (TTR), also known as prealbumin, is a protein mainly produced by the liver, and it acts as a plasma transporter of thyroxine and retinol, carrying both in the blood as well as in the cerebrospinal fluid.

Besides being an interesting marker to assess the nutritional status of patients, TTR plays an important role in hereditary amyloidosis. Hereditary amyloidosis is a rare genetic disease with adult onset. The manifestations may vary and can precede the actual disease by several years. The pathology can affect the peripheral nervous system, leading to a symmetric axonal sensory-motor polyneuropathy. Damage starts with smaller-diameter fibers and progressively extends to larger ones, eventually resulting in loss of ambulation. Cardiac involvement may also occur (either isolated or in conjunction with peripheral nervous system manifestations). Hence the need to identify molecules capable of binding the TTR binding pockets, contributing to the stabilization of its tetrameric structure and counteracting amyloid fibril formation.

Based on an already established crystallization protocol, in this thesis project it was possible to obtain crystals of Wild-Type TTR in complex with small stabilizing molecules synthesized by the research group where I carried out my thesis work. From the analysis of the crystals obtained, it was possible to study the TTR–ligand interaction, thereby gathering useful information for designing molecules with potentially higher affinity for the binding sites.