• cell T
• engineered thymus
• ingegneria tissutale
• linfociti T
• timo
• timo ingegnerizzato. Thymus
• tissue engineering

Il timo è un organo linfoide primario deputato alla maturazione dei linfociti T, che dal midollo osseo migrano nel timo e, una volta maturi, si distribuiscono negli organi linfoidi periferici. Dunque, tale organo è di fondamentale importanza per un corretto funzionamento del sistema immunitario.
L'ingegnerizzazione del timo consiste nella riproduzione in vitro del microambiente timico, sia in termini di caratterizzazione meccanica, sia in termini della sua microstruttura. L'obiettivo è quello di creare uno scaffold, in cui le cellule T sono in grado di sopravvivere e proliferare, da poter utilizzare nello studio di patologie del sistema immunitario, in terapie innovative che sfruttano linfociti T ingegnerizzati, in terapie personalizzate e in sostituzione di test su animali.
Sebbene sia così importante, il timo è un organo spesso dimenticato e poco studiato, infatti in letteratura si trovano pochi studi relativi ad una sua caratterizzazione meccanica e strutturale, che siano finalizzati ad una sua ingegnerizzazione.
Per tale motivo, in questo lavoro di tesi, è stata eseguita dapprima una caratterizzazione meccanica del tessuto timico. Sono stati testati campioni di timo di vitello, utilizzando un unico strumento (Biomomentum-Mach 1) che ha permesso di eseguire diversi tipi di test meccanici: stress relaxation (bulk, locale), epsilon dot e DMA. I risultati ottenuti, sebbene differiscano in base al tipo di test condotto, in tutti i casi hanno evidenziato un comportamento di tipo viscoelastico, tipico dei tessuti molli.
Successivamente, è stata condotta un'analisi strutturale, mediante immagini istologiche, realizzate con colorazioni H&E (ematossilina & eosina), e immagini SEM (microscopia a scansione di elettroni). Da quest'ultime è emerso come il timo abbia una microstruttura altamente fibrosa.
La caratterizzazione meccanica e l’analisi strutturale sono state il punto di partenza per l'ingegnerizzazione del timo mediante la realizzazione di idrogel. La scelta dei materiali è ricaduta su agarosio e gelatina, entrambi materiali biocompatibili e largamente utilizzati in ambito dell'ingegneria biomedica. Il primo è in grado di formare gel stabili a temperatura ambiente, inerti chimicamente, trasparenti, con porosità controllabile in base alla concentrazione e in grado di fornire supporto per la crescita cellulare. Il secondo, derivato dal collagene mediante idrolisi, è biodegradabile e consente di realizzare gel a temperatura ambiente, trasparenti, in cui è in grado di favorire l'adesione cellulare. I gel sono stati liofilizzati al fine di ottenere una struttura porosa e successivamente reidratati in acqua per poter essere testati. Le analisi meccaniche hanno permesso di individuare la concentrazione di agarosio da utilizzare nei gel, al fine di ottenere proprietà meccaniche simili al tessuto di partenza. Tuttavia, l'analisi SEM ha evidenziato una struttura di tipo alveolare e non fibrillare.
Dunque, nei gel sono state inserite delle fibre di Bionate e gelatina (50:50), ottenute mediante la tecnica dell'electrospinning, con lo scopo di ricreare una struttura fibrillare come quella timica.
Nuovamente, i gel con le fibre al loro interno sono stati testati dal punto di vista meccanico.
In conclusione, questo studio rappresenta il punto di partenza per un'ingegnerizzazione del microambiente timico. Studi futuri dovranno essere incentrati sul perfezionamento della caratterizzazione meccanica del timo (ad esempio, si potranno considerare le prove di “shear”, in questo studio non trattate).
Inoltre, nuove formulazioni di gel potranno essere prese in esame, per cercare di mimare più accuratamente non solo le proprietà meccaniche dell’organo, ma anche quelle strutturali.
Dopodiché, dovranno essere testate l’adesione, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare sui costrutti prodotti. Una volta raggiunto quest'obiettivo, il timo ingegnerizzato, rappresentando l'ambiente ideale in cui far crescere e proliferare linfociti T, potrebbe portare grossi vantaggi e sviluppi negli studi fisiopatologici del sistema immunitario, nello studio di terapie personalizzate, incluse le tecniche più innovative anche in ambito emato-oncologico, in cui si utilizzano linfociti T ingegnerizzati.

The thymus is a primary lymphoid organ responsible for the maturation of T lymphocytes, which migrate from the bone marrow to the thymus and, once matured, are distributed to peripheral lymphoid organs. As a result, this organ plays a crucial role in ensuring the proper functioning of the immune system.
Thymus engineering involves recreating the thymic microenvironment in vitro, both in terms of its mechanical properties and its microstructure. The aim is to develop a scaffold in which T cells can survive and proliferate, to be used in studying immune system disorders, in innovative therapies utilizing engineered T lymphocytes, in personalized therapies, and as an alternative to animal testing.Despite its significance, the thymus is often overlooked and under-researched. In fact, there are few studies in the literature focusing on its mechanical and structural characterization with the aim of engineering it.
For this reason, this thesis initially focused on the mechanical characterization of thymic tissue. Veal thymus samples were tested using a single instrument (Biomomentum-Mach 1), which enabled a variety of mechanical tests, including bulk and local stress relaxation, epsilon dot, and DMA. Although the results varied depending on the type of test, they consistently showed viscoelastic behavior, typical of soft tissues.
Following this, a structural analysis was performed using histological images stained with H&E (hematoxylin & eosin) and SEM (scanning electron microscopy) images. These analyses revealed that the thymus possesses a highly fibrous microstructure.
The mechanical characterization and structural analysis served as the starting point or thymus engineering through the development of hydrogels. The chosen materials were agarose and gelatin, both of which are biocompatible and widely used in biomedical engineering. Agarose is capable of forming stable gels at room temperature, is chemically inert, transparent, and has controllable porosity depending on concentration, making it suitable for supporting cell growth. Gelatin, derived from collagen through hydrolysis, is biodegradable and allows for the formation of transparent gels at room temperature, promoting cell adhesion. The gels were lyophilized to obtain a porous structure and subsequently rehydrated in water for testing. Mechanical analyses identified the optimal concentration of agarose for achieving mechanical properties similar to those of the original tissue. However, SEM analysis revealed an alveolar, rather than fibrillar, structure.
To address this, Bionate and gelatin fibers (50:50), produced through electrospinning, were incorporated into the gels to replicate a fibrillar structure similar to that of the thymus. The gels with embedded fibers were then mechanically tested again.
In conclusion, this study lays the groundwork for engineering the thymic microenvironment. Future research should focus on refining the mechanical characterization of the thymus (for instance, shear tests, which were not covered in this study, could be considered).
Additionally, new gel formulations should be explored to better mimic not only the mechanical properties of the organ but also its structural characteristics. Following this, it will be necessary to test the adhesion, proliferation, and survival of cells on the produced constructs. Once these objectives are achieved, the engineered thymus, by providing an ideal environment for the growth and proliferation of T cells, could significantly advance research into immune system pathologies and the development of personalized therapies, including innovative techniques in hematology-honcology field, where engineered T cells are used.