• CRISPR/Cas9
• Genome editing
• acido ascorbico
• ascorbic acid
• Lactuca sativa
• lattuga

Riassunto
L’acido ascorbico (AsA) è un antiossidante dei tessuti vegetali. Il suo metabolismo è complesso e nelle piante si conoscono più vie biosintetiche. Aumentare il contenuto di AsA nei tessuti vegetali è un obbiettivo di interesse perché le piante biofortificate aumentano il loro valore nutrizionale, possono dimostrarsi meno suscettibili a stress abiotici e più resistenti a imbrunimenti post-raccolta. Questa tesi ha l’obbiettivo di valutare se un editing genomico (CRISPR/Cas9) condotto sui geni (MDHAR e CSN) che codificano per molecole putativamente coinvolte nella regolazione negativa della biosintesi di AsA, possa incrementare il contenuto di vitamina C in lattuga. Le piante rigenerate (T1), derivate da infezione attraverso Agrobacterium tumefaciens per veicolare i componenti del sistema CRISPR/Cas9, sono state valutate mediante PCR per la presenza dei geni Cas9 e NPTII. Dalle piante positive si sono amplificate e sequenziate le regioni dei geni target contenti le guide (gRNAs) per individuare eventuali eventi di editing. In piante T2, è stato effettuato lo screening per valutare l’editing in omozigosi. L’AsA è stato estratto da foglie editate di piante omozigoti. I valori di AsA di piante di controllo ed editate sono stati sottoposti ad ANOVA e test di Tukey’s. Un aumento significativo di AsA è stato registrato in mutanti mdhr2 e mdhr3. I dati suggeriscono che il silenziamento di regolatori negativi può essere una strategia utile per aumentare il contenuto in AsA.

Abstract
Ascorbic acid (AsA) is an antioxidant in plant tissues. Its metabolism is complex, and multiple biosynthetic pathways are known in plants. Increasing AsA content in plant tissues is a key aim because biofortified plants increase their nutritional value, they can be less susceptible to abiotic stresses and more resistant to postharvest browning. This thesis aims to evaluate whether genomic editing (CRISPR/Cas9) conducted on genes (MDHAR and CSN) encoding for molecules putatively involved in the negative regulation of AsA biosynthesis can increase vitamin C content in lettuce. Regenerated plants (T1), derived from infection through Agrobacterium tumefaciens to carry elements of the CRISPR/Cas9 system, were evaluated by PCR for the presence of the Cas9 and NPTII genes. Regions of the target genes containing the guides (gRNAs) were amplified and sequenced to detect mutations in the positive plants. Molecular analyses to identify editing events in homozygous condition were performed in T2 plants. AsA was quantified in edited leaves of homozygous plants. AsA data of wild type and edited plants were subjected to ANOVA and Tukey's test. A significant increase in AsA was identified in mdhr2 and mdhr3 mutants. The results suggest that knockout of negative regulators can increase AsA content in lettuce.