• VINO Ocratossina A

Introduzione: L'Ocratossina A (OTA) è una micotossina prodotta da molte specie di Aspergillus e Penicillium. Contamina mangimi ed alimenti, specialmente cereali e derivati del grano. Recentemente basse concentrazioni sono state rilevate in alcune bevande come nel caffè, nella birra, nel succo d'uva e nel vino, causando un allarme nell'opinione pubblica e nelle alte autorità. L'OTA ha attività nefrotossica e cancerogena nel rene. I suoi metaboliti sono genotossici e formano complessi con il DNA delle cellule renali in specie animali diverse. E' stato dimostrato che l'OTA induce la formazione di radicali liberi dell'ossigeno con conseguente perossidazione lipidica e danno cellulare. E' stato riscontrato che l'OTA è uno degli agenti coinvolti nello sviluppo della Nefropatia Endemica dei Balcani (BEN), una malattia cronica caratterizzata da alterata funzionalità e fibrosi renale. Uno studio precedente, svolto nel nostro laboratorio, ha dimostrato che la somministrazione acuta di OTA nei ratti provoca un danno tubulo-tossico, diminuzione della funzionalità renale oltre che al danno ossidativo a livello tubulare, mentre nella somministrazione di OTA associata al vino ed all'etanolo si ha la riduzione della funzionalità renale ma diminuisce il danno ossidativo, quindi si ha una protezione da parte di questi.
Scopo del lavoro: Sulla base dei dati ottenuti dal precedente studio, abbiamo deciso di valutare le alterazioni patologiche a livello renale dopo somministrazione sub-cronica di OTA e l'eventuale protezione da parte dei numerosi anti-ossidanti presenti nel vino. L'esperimento è stato condotto in un modello sperimentale in vivo, utilizzando ratti Wistar.
Materiali e Metodi: Sessanta ratti Wistar maschi (180-200gr.) sono stati suddivisi in 6 gruppi: 1) Gruppo controllo a cui è stata somministrata acqua, 2) Gruppo Vino a cui è stato somministrato vino rosso (Barbera d'Asti con gradazione alcolica pari al 13.5%), 3) Gruppo Et-OH in cui i ratti hanno ricevuto etanolo al 13.5% in acqua 4) Gruppo OTA in cui i ratti hanno ricevuto una dose di OTA (Sigma Aldrich Missouri USA) pari a 289 microgr/Kg/48 ore, 5) Gruppo OTA-vino in cui ratti hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289 microgr/Kg/48 ore disciolta nel vino con una gradazione alcolica pari al 13.5%, 6) Gruppo OTA-EtOH in cui i ratti hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289 microgr./Kg/48 ore disciolta in etanolo al 13.5% (soluzione acquosa). Il trattamento è stato condotto per 3 mesi. Gli animali hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289 microgr./Kg/48 ore per indurre un sicuro effetto lesivo a livello renale.L'OTA è stata disciolta in NaHCO3 0.1 M (pH 7.4), quindi diluita ulteriormente in H2O, vino rosso (Barbera d'Asti con gradazione alcolica pari al 13.5%) ed etanolo al 13.5%. I ratti hanno ricevuto 0.5ml delle rispettive soluzioni mediante sonda gastrica e le urine sono state raccolte al 15°, 30°, 60°e 90°giorno di trattamento. Al 90° giorno gli animali sono stati sacrificati e sono stati raccolti campioni di sangue e di tessuto renale al fine di determinare la creatinina sierica, l'enzimuria (considerando l'N-acetil-betaglucosaminidasi NAG), la proteinuria, il contenuto di lipoperossidi nel tessuto renale (LPO) ed i livelli della superossido dismutasi tissutale (SOD). Per l'analisi morfologica i preparati renali inclusi in paraffina, sono stati colorati con Rosso Sirius, un colorante istologico specifico per il collagene; la quantificazione del collagene presente è stata effettuata mediante analisi dell'immagine utilizzando un software adatto. E' stata eseguita una analisi molecolare per valutare l'espressione di geni correlati con il processo di fibrosi; in particolare sono stati valutati i livelli di mRNA del collagene interstiziale (tipo I e III) ed i livelli di mRNA del Transforming Growth Factor beta1 (TGF beta1). Sono stati inoltre considerati i pesi corporei e dei reni, oltre alla cellularità glomerulare dopo aver colorato fette di reni mediante colorazione PAS. Mediante dosaggio ELISA sono stati valutati i valori di IL-6 sierica dei vari gruppi trattati. (Bender Med Systems).
Risultati: Analizzando la creatinina sierica si osserva una alterata funzionalità renale nei gruppi 3 e 4 (0.66+/- 0.23 mg/dl; 0.68+/- 0.26 vs 1 e 2, p< 0.05), mentre nei gruppi 2 e 5 i valori risultano pressochè simili al controllo. Analizzando l'enzimuria (NAG) si osserva un andamento particolare nel gruppo 4: al 15°giorno si ha un significativo aumento rispetto agli altri gruppi (3.38+/- 1.20 p< 0.05 valore incrementale), per poi ridursi al 30°e 60°giorno e aumentare significativamente al 90°, come anche nel gruppo 3 (7.43+/- 2.10; 9.74+/- 2.40 vs 1, 2, 5, 6. p<0.05). Per quanto riguarda la proteinuria, viene evidenziato un effetto nefrotossico dell'OTA a tutti i tempi considerati, (2.39+/- 0.43 vs 1, 4.08+/- 0.67; 2.97+/- 0.47 vs 1 e 5, 2.55+/- 0.32 vs 1, 5 e 6 p< 0.05); si osserva inoltre un aumento significativo a partire dal 30° giorno fino al 90°del gruppo 3 (3.70+/- 0.37; 3+/- 0.30, vs 1, 5; 3.22+/- 0.32 vs 1, 5 e 6 p< 0.05); al 60°giorno si evidenzia un significativo aumento della proteinuria nel gruppo 6 (2.19+/- 0.41 vs 1 e 5; p< 0.05). I livelli di LPO sono significativamente aumentati nei gruppi 3, 4, 6 (3.56+/- 2.20; 3.94+/- 1.42; 3.46+/- 1.15 mmol/g prot. vs 1, 2 e 5. p< 0.05), mentre i livelli di SOD diminuiscono significativamente solamente nel gruppo 4 (25.92+/- 13.17 U/mg prot. Vs 1, 2 e 5.). L'analisi molecolare dell'espressione dei livelli di mRNA del COL (tipo I e III) ed i livelli di mRNA del TGFbeta 1 non ha evidenziato significative variazioni. Al momento del sacrificio si notava una differenza significativa nel peso dei reni dei gruppi 1 e 3 vs 4, 6 e 5 (1.06+/- 0.10; 1.06+/- 0.10 p<0.05). I gruppi 3, 4 e 6 evidenziano livelli significativamente più´ alti di IL-6 sierica rispetto ai gruppi 1, 2 e 5 (76.94+/- 19.98; 110.21+/- 26.36; 83.19+/- 34.23. p< 0.05).
Discussione: I nostri dati mettono in evidenza che le concentrazioni di OTA contenute nel vino non esplicano effetti tossici a livello renale. Quando l'OTA viene somministrata in dosaggi elevati si osserva un aumento dei livelli sierici di IL-6 al 90°giorno ed alterazione dei parametri renali quali l'aumento del peso dei reni, della creatinina sierica, dell'enzimuria, della proteinuria, del contenuto renale di lipoperossidi e dell'attività della SOD tissutale.Per quanto riguarda i dati sull'enzimuria e sulla proteinuria nel gruppo OTA, è da sottolineare l'andamento oscillante con "picchi" ai giorni 15 e 90 dovuto probabilmente all'alternarsi di fasi di necrosi e rigenerazione cellulare. Questi andamenti, come anche analoghi incrementi dei parametri in studio, si osservano nel gruppo trattato con etanolo, mentre il gruppo trattato con vino non presenta queste alterazioni. Quando l'OTA viene disciolta nel vino non si evidenziano effetti tossici, anzi si ha una protezione; tale protezione è probabilmente a carico della componente non-alcolica del vino, dato che il gruppo OTA-EtOH mostra un minor grado di protezione.
In conclusione: la somministrazione sub-cronica di OTA determina effetti tossici a livello renale mentre le caratteristiche farmacologiche delle componenti non alcoliche del vino sembrano ridurre sia il danno tubulare che quello ossidativo .