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La retina dei Vertebrati è l'organo di senso deputato alla trasduzione del segnale luminoso. Istologicamente, la retina presenta una tipica organizzazione trilaminare: lo strato nucleare esterno, contenente i fotorecettori, lo strato nucleare interno, contenente cellule bipolari, orizzontali, amacrine e cellule della glia di Müller, e lo strato di cellule gangliari, che con i loro assoni costituiscono il nervo ottico. Le malattie degenerative della retina, come la Retinite pigmentosa, portano alla graduale perdita della vista mediante l'attuazione di un programma multifasico di morte cellulare e di perdita dell'organizzazione trilaminare retinica. Tale neurodegenerazione potrebbe essere efficacemente contrastata con una terapia basata sulla “sostituzione cellulare”, cioè sul trapianto in organo di cellule staminali o progenitori capaci di sostituire le cellule in degenerazione dell'ospite. Tale approccio richiede anzitutto una fase di differenziamento in vitro di cellule staminali multipotenti, al fine di ottenere cellule indirizzate verso un destino retinico, capaci di integrarsi nel tessuto ospite e differenziarsi in tutti i sottotipi cellulari affetti dalla degenerazione.
Xenopus laevis rappresenta un buon modello per lo studio della funzione genica e dello sviluppo dell'occhio. I suoi embrioni possono essere microiniettati durante le prime fasi di sviluppo con RNA messaggeri trascritti in vitro. Successivamente, allo stadio di blastula, gli emisferi animali (animal cap), ai quali compete un destino epidermico se non diversamente trattati, possono essere asportati e coltivati in soluzione salina. Ciò consente di utilizzare queste cellule come materiale biologico di partenza per saggi di differenziamento, dove la sovraespressione di geni coinvolti nella specificazione di tipi cellulari retinici può istruire le cellule dell’animal cap e indirizzarle verso un particolare destino.
Nel laboratorio dove ho svolto il mio internato di tesi da molti anni si studiano i meccanismi molecolari del differenziamento retinico nell'anfibio Xenopus laevis. Diversi fattori di trascrizione di tipo homeobox, come Xotx5, Xotx2 e Xvsx1, sono importanti per il differenziamento di specifici neuroni retinici. La trascrizione e la traduzione dei geni sopraelencati vengono finemente regolate nel tempo e nello spazio all’interno della retina di Xenopus. Esperimenti di trasfezione in vivo hanno dimostrato che Xotx5 promuove il destino di fotorecettori, mentre Xotx2 e Xvsx1 promuovono entrambi il destino bipolare.
Più recentemente è stato evidenziato il ruolo di noggin nell'indurre un destino retinico in cellule embrionali multipotenti, quali le cellule staminali embrionali della calotta animale (ACES). L’iniezione di mRNA di noggin determina l’espressione di marcatori terminali di differenziamento retinico in cellule animali (animal cap cells) della blastula di Xenopus, coltivate in vitro.
In seguito a trapianto in vivo, cellule della calotta animale esprimenti alte dosi di noggin formano occhi ben sviluppati, sia quando trapiantate nella regione presuntiva dell’occhio sia quando inserite in posizione ectopica posteriore, anche se negli occhi derivanti dai trapianti posteriori non si ha mai la formazione del cristallino.

Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato duplice:
· Innanzitutto mi sono occupato di verificare la funzionalità degli occhi derivati da trapianto di animal cap iniettati con noggin mRNA. Questo è stato realizzato con tecniche di elettrofisiologia, quali patch-clamp e registrazione di risposta alla luce. In particolare, ho effettuato trapianti di animal cap in vivo, rimuovendo metà del campo morfogenetico dell’occhio di embrioni di Xenopus a stadio di neurula (st. 15) e sostituendolo con animal cap iniettati con noggin mRNA. Ho quindi allevato i girini, sia wild type (WT) di controllo che animali sottoposti a trapianto, fino a stadi tardivi e recuperato gli occhi a stadio di sviluppo 46/47 tramite dissezione sotto luce infrarossa o rossa; ho poi ripulito gli occhi da epitelio pigmentato e cristallino, e ho infine ridotto il materiale in frammenti adatti all’applicazione di tecniche di elettrofisiologia, dissociando o meno le cellule con opportuni enzimi a seconda delle esigenze. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il Prof. Gian Carlo Demontis (Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie, Università di Pisa), che ha effettuato le registrazioni elettrofisiologiche. La tecnica del patch-clamp perforato è servita a verificare la presenza di canali voltaggio-dipendenti caratterizzanti i fotorecettori, mentre la suzione del segmento esterno è stata il punto di partenza per la registrazione di risposte a lampi di luce con lunghezza d’onda di 520 nm (adatta alla stimolazione dei bastoncelli).
· Inoltre, nel mio lavoro di tesi ho anche indagato sulla potenzialità di Xotx5 nell’indurre un differenziamento fotorecettoriale. Senza la compresenza di altri fattori implicati nel differenziamento retinico, l’azione della sola proteina Noggin induce un differenziamento retinico generale, dove la calotta animale risulta arricchita di popolazioni cellulari corrispondenti ai vari tipi retinici dell’occhio WT. Mi sono occupato quindi di analizzare se la microiniezione di noggin + Xotx5 fosse in grado di indirizzare le cellule della calotta animale non più verso destini retinici generali bensì verso lo specifico destino di fotorecettore. Tecniche quali ibridazione in situ, immunoistochimica e PCR quantitativa Real Time hanno consentito di analizzare il differenziamento cellulare avvenuto all’interno degli animal cap.

Per quanto riguarda la prima parte del mio lavoro, l’analisi dei risultati ha mostrato notevole somiglianza di funzionamento e differenziamento tra fotorecettori WT e fotorecettori derivanti da occhi trapiantati: in entrambi i casi viene espresso in membrana lo stesso set di canali ionici e si riscontrano risposte alla luce equivalenti. Inoltre la circuiteria retinica è perfettamente funzionante nel recepire e trasdurre, attraverso neuroni di secondo ordine, lo stimolo luminoso captato in primis dai fotorecettori.
I risultati ottenuti durante la seconda parte del mio internato di tesi, invece, hanno mostrato come la coiniezione di Xotx5 con alte dosi di noggin determini un aumento di espressione del gene opsina, marcatore di fotorecettori terminalmente differenziati, oltre a un aumento percentuale di cellule opsina-positive e alla facilitazione dell’organizzazione di tali cellule in strati ordinati. Ciò candida Xotx5 come possibile fattore di differenziamento da impiegare in associazione a noggin per l’ottenimento di fotorecettori in vitro, da utilizzarsi in protocolli di terapia cellulare sostitutiva.