ETD

• Chronic Lymphocitic leukemia
• lymphnodes
• multiparametric ultrasound

Response assessment in chronic lymphocytic leukemia (CLL) continues to rely on the iwCLL criteria, which represent the current clinical reference standard. However, the introduction of targeted therapies, particularly Bruton tyrosine kinase inhibitors (BTKi), has profoundly changed the kinetics and quality of tissue response. A lymph node is not merely a structure measurable in centimeters, but a biologically complex microenvironment in which leukemic cells, stroma, vessels, and immune components interact and may undergo asynchronous changes during treatment.
This observation provided the rationale for the present thesis: to investigate whether high-definition, truly multiparametric hematologic ultrasound (US-HD) can characterize aspects of lymph-node response that are not fully captured by conventional clinical and dimensional assessment. The aim is not to replace iwCLL criteria, but rather to determine whether additional tissue-level information can be obtained using a repeatable, radiation-free imaging technique suitable for the long-term follow-up of patients receiving continuous therapy.
In this study, ultrasound was not used simply to measure lymph-node diameters. The US-HD classification was multiparametric from the outset and integrated, for each anatomical compartment, lymph-node dimensions and shape, cortical echostructure and the presence of cortical reticulation, characteristics of the echogenic hilum, and vascular patterns assessed by Color Doppler. This aspect is essential for the correct interpretation of the study.
Global US-HD response was defined according to a hierarchical approach: the anatomical compartment showing the least favorable response determined the overall response category. Consequently, even a single lymph node with persistent multiparametric abnormalities could preclude classification as an ultrasound complete response, despite normalization of all other anatomical sites. This approach parallels the logic of iwCLL criteria, in which even a single lymph node ≥1.5 cm precludes classification as complete response (CR), within the context of the other required criteria.
This prospective observational study included 65 patients with CLL treated in the first-line setting with continuous covalent BTK inhibition using zanubrutinib, acalabrutinib, or ibrutinib. Comparison among individual BTKi was not an endpoint of the study; therefore, treatment distribution is reported solely as a characteristic of the study population, without comparative efficacy inferences. Patients were assessed at baseline and subsequently underwent ultrasound examinations at approximately three-month intervals. Follow-up duration was not identical for all patients, consistent with the continuous nature of BTKi therapy. Best ultrasound response was individually defined as the best response achieved during follow-up that was not further improved at subsequent assessments.
The first major finding was that iwCLL and US-HD did not always provide the same response classification. Among 65 patients, 17 (26.2%; 95% CI, 16.0–38.5%) showed discordant global response classifications, despite substantial overall agreement (weighted κ=0.742). Importantly, discordance showed a clear direction: in 14 of the 17 discordant cases, US-HD assigned a less favorable response category than iwCLL.
This finding was particularly relevant among patients classified as having a complete response according to iwCLL. Of the 26 iwCLL-CR patients, only 13 were also classified as CR by US-HD, whereas the remaining 13 (50%) were classified as ultrasound partial response (PR). This does not imply that iwCLL assessment is incorrect, nor that these patients necessarily harbor residual viable disease. Rather, it indicates that multiparametric ultrasound continues to identify tissue abnormalities that are insufficient to modify conventional clinical response classification.
Discordance was not uniformly distributed across anatomical sites. It was considerably more evident in superficial lymph-node compartments—cervical, axillary, and inguinal—than in abdominal compartments and the spleen. In the mixed-effects model, superficial compartments had approximately 6.7-fold higher odds of receiving a less favorable US-HD classification than deep compartments/spleen. Methodologically, this is readily interpretable because superficial lymph nodes are conventionally assessed primarily by physical examination, whereas ultrasound allows direct visualization of non-palpable nodes and assessment of their internal architecture. A biological interpretation is also possible, namely that tissue remodeling during BTKi therapy may differ among anatomical sites; however, this remains hypothetical in the absence of histological correlation.
An important methodological finding emerging from the final review was the availability of two complete assessments of the entire cohort. The first assessment was performed by a senior hematologist with approximately 20 years of ultrasound experience and specific expertise in hematologic ultrasonography. The entire cohort was subsequently reassessed by a second hematologist with dedicated training in hematologic ultrasonography, certified advanced SIUMB courses, and a university Master's degree in clinical ultrasonography from Humanitas University.
Interobserver agreement was extremely high: 322 of 325 compartment-level assessments were concordant (99.1%), with weighted κ values ranging from 0.973 to 1.000. Global US-HD response was concordant in all 65 patients (κ=1.000). The only three discrepancies involved CR versus PR classification within a single anatomical compartment and never affected the overall response category. These findings indicate that a structured approach can achieve excellent reproducibility when applied by hematologists with specific training in hematologic ultrasonography.
Among the 13 patients classified as iwCLL-CR but US-HD-PR, one patient showed an isolated residual splenic abnormality rather than residual lymph-node abnormalities. Because the subsequent exploratory analysis aimed specifically to characterize the residual lymph-node phenotype, this patient was excluded only from the nodal subanalysis. The candidate Residual Ultrasound Disease (RUD) group therefore comprised 12 patients.
A further methodological feature strengthens this analysis: in all 12 cases, the lymph node assessed at best response was the same target lymph node identified at baseline. Thus, the analysis did not compare different lymph nodes selected at different time points, but longitudinally evaluated remodeling of the same anatomical structure during treatment.
One of the most relevant findings of the longitudinal analysis was that candidate RUD lymph nodes showed a clear therapeutic response. From baseline to best response, both long- and short-axis diameters decreased significantly. The short-to-long axis ratio also decreased, indicating true geometric remodeling toward a relatively more elongated configuration.
Comparison with US-HD-CR controls further supported this concept. Percentage reductions in long- and short-axis diameters did not differ significantly between the two groups. Nevertheless, RUD lymph nodes remained larger at best response and showed a more pronounced longitudinal change in the short-to-long axis ratio. Candidate RUD therefore does not appear to simply reflect insufficient dimensional reduction; rather, it represents persistence of an incompletely normalized ultrasound phenotype despite substantial tissue remodeling.
All 12 candidate RUD lymph nodes showed cortical reticulation, an oval shape, and a visible echogenic hilum. Doppler vascularity was predominantly hilar, with a mixed pattern in three cases. Cortical reticulation was substantially less frequent among US-HD-CR controls.
Although this finding could initially suggest that cortical reticulation represents the main “marker” of RUD, a more rigorous methodological interpretation requires caution. Cortical reticulation was already one of the parameters used to assign multiparametric US-HD response. Subsequently comparing its prevalence between RUD and US-HD-CR controls therefore introduces incorporation bias and an element of circularity. Cortical reticulation should consequently be regarded as a recurrent feature of the candidate phenotype rather than as an independently validated marker. The central finding is instead the coexistence of marked dimensional and geometric remodeling with persistent multiparametric abnormalities, avoiding reduction of RUD to a single ultrasound feature.
Because BTKi therapy is administered continuously, it was important to exclude the possibility that the RUD group had simply been assessed “too early.” Median time to best US-HD response was 26.7 months in candidate RUD patients and 18.9 months in US-HD-CR controls, with no evidence of a significant difference (p=0.840). This finding makes it less likely that the observed differences were solely attributable to systematically earlier assessment in RUD patients. However, given the small sample size of 12 patients per group and the wide confidence interval, equivalence of response times cannot be claimed. The finding should therefore be considered reassuring with regard to potential temporal bias, but not definitive.
RUD is proposed as an exploratory imaging concept. It does not represent measurable residual disease (MRD), nor does it automatically imply persistence of viable CLL. MRD quantifies residual leukemic cells in a biological sample, typically peripheral blood or bone marrow, whereas US-HD describes the structure of a tissue compartment. These represent different levels of observation.
An ultrasound-abnormal lymph node after treatment may contain residual leukemic cells, but it may alternatively reflect stromal remodeling, fibrosis, changes in the lymphatic or vascular network, or a combination of these processes. Without histology or another independent reference standard, the present study cannot resolve this question. RUD is therefore proposed as a candidate residual imaging phenotype, rather than as an ultrasound equivalent of MRD.
Overall, this thesis proposes moving “beyond dimensional response” without challenging the central role of iwCLL criteria. Multiparametric US-HD allows lymph nodes to be observed as tissues that change over time, rather than simply as diameters. In patients receiving continuous BTKi therapy, a substantial proportion of complete responses according to iwCLL retain residual ultrasound abnormalities. These abnormalities are particularly frequent in superficial compartments and may persist despite marked dimensional reduction and significant geometric remodeling.
At present, Residual Ultrasound Disease represents a working hypothesis: an ultrasound-detectable and potentially reproducible residual tissue phenotype whose biological and clinical significance remains to be established. It is precisely this open question—rather than a definitive conclusion—that represents the main scientific value and future perspective of this project.

La valutazione della risposta nella leucemia linfatica cronica (LLC) continua a basarsi sui criteri iwCLL, che rappresentano lo standard clinico di riferimento. Tuttavia, l'introduzione delle terapie target e in particolare degli inibitori di BTK ha modificato profondamente la cinetica e la qualità della risposta tissutale. Il linfonodo non è soltanto una struttura misurabile in centimetri: è un microambiente biologicamente complesso, nel quale cellule leucemiche, stroma, vasi e componenti immunitarie interagiscono e possono modificarsi in modo non sincrono durante il trattamento.
Da questa osservazione nasce il razionale della tesi: verificare se un'ecografia ematologica ad alta definizione e realmente multiparametrica possa descrivere aspetti della risposta linfonodale che non sono completamente rappresentati dalla valutazione clinico-dimensionale convenzionale. L'obiettivo non è sostituire i criteri iwCLL, ma capire se esista una quota di informazione tissutale aggiuntiva ottenibile con una metodica ripetibile, priva di radiazioni e adatta al follow-up prolungato dei pazienti in terapia continuativa.
Nel lavoro l'ecografia non è stata utilizzata semplicemente per misurare il diametro dei linfonodi. La classificazione US-HD era multiparametrica fin dall'inizio e integrava, per ciascun compartimento anatomico, dimensioni, forma del linfonodo, ecostruttura corticale e presenza di reticolatura, caratteristiche dell'ilo ecogeno e pattern vascolare al Color Doppler. Questo punto è essenziale per interpretare correttamente tutto lo studio.
La risposta globale US-HD veniva definita secondo una logica gerarchica: il compartimento con la risposta meno favorevole determinava la risposta globale. Di conseguenza, anche un singolo linfonodo con persistente alterazione multiparametrica poteva impedire la classificazione ecografica di risposta completa, pur in presenza di normalizzazione degli altri distretti. Questa impostazione richiama la logica iwCLL, nella quale anche un singolo linfonodo ≥1,5 cm impedisce la classificazione come CR, naturalmente nel contesto degli altri criteri richiesti.
Lo studio prospettico osservazionale ha incluso 65 pazienti con LLC trattati in prima linea con un inibitore covalente di BTK in modalità continuativa: zanubrutinib, acalabrutinib o ibrutinib. Il confronto tra i singoli BTKi non rappresentava un endpoint dello studio e la distribuzione dei trattamenti viene quindi descritta come caratteristica della popolazione, senza inferenze comparative di efficacia.
I pazienti venivano valutati al baseline e successivamente con controlli ecografici approssimativamente trimestrali. La durata del follow-up non era uguale per tutti, coerentemente con la natura continuativa della terapia. La migliore risposta ecografica è stata definita individualmente come la migliore risposta raggiunta nel corso del follow-up e non ulteriormente migliorata nei controlli successivi.
Il primo risultato importante è che iwCLL e US-HD non forniscono sempre la stessa classificazione. Su 65 pazienti, 17 (26,2%; IC95% 16,0–38,5%) presentavano una risposta globale discordante, pur in presenza di una concordanza complessiva sostanziale (κ pesato 0,742). La discordanza aveva inoltre una direzione precisa: in 14 dei 17 casi discordanti l'US-HD assegnava una categoria di risposta meno favorevole rispetto a iwCLL.
Il dato diventa particolarmente interessante nei pazienti considerati in risposta completa secondo iwCLL. Dei 26 pazienti iwCLL-CR, soltanto 13 risultavano CR anche all'US-HD; gli altri 13, cioè il 50%, rimanevano classificati come PR ecografica. Questo non significa che iwCLL “sbagli” o che questi pazienti abbiano necessariamente malattia vitale residua: significa che la valutazione ecografica multiparametrica continua a riconoscere alterazioni tissutali non sufficienti a modificare la classificazione clinica convenzionale.
La discordanza non era distribuita uniformemente. Era molto più evidente nei linfonodi superficiali — collo, ascelle e inguini — rispetto ai compartimenti addominali e splenici. Nel modello mixed, i compartimenti superficiali mostravano odds circa 6,7 volte maggiori di una classificazione US-HD meno favorevole rispetto ai compartimenti profondi/milza.
Questo risultato ha una lettura metodologica immediata: nella pratica convenzionale i linfonodi superficiali sono valutati soprattutto mediante esame obiettivo, mentre l'ecografia permette di visualizzare direttamente nodi non più palpabili e di studiarne l'architettura interna. Esiste anche una possibile lettura biologica, cioè che il rimodellamento tissutale durante BTKi possa non essere identico in tutti i distretti; questa seconda interpretazione rimane però ipotetica in assenza di correlazione istologica.
Un elemento metodologico rilevante emerso dalla revisione finale è la disponibilità di due valutazioni complete dell'intera coorte. La prima valutazione è stata eseguita da un ematologo senior con circa vent'anni di esperienza ecografica e specifica expertise nell'ecografia ematologica; l'intera casistica è stata successivamente rivalutata da un secondo ematologo con formazione dedicata in ecografia ematologica, corsi avanzati certificati SIUMB e Master universitario in ecografia clinica presso Humanitas University.
La concordanza è risultata estremamente elevata: 322 delle 325 valutazioni di compartimento erano concordanti (99,1%), con κ pesati compresi tra 0,973 e 1,000. La risposta globale US-HD era concordante in tutti i 65 pazienti, κ=1,000. Le sole tre differenze riguardavano una classificazione CR versus PR in un singolo compartimento e non modificavano mai la risposta globale.
Questo risultato dimostra che un approccio strutturato può raggiungere un'eccellente riproducibilità quando viene applicato da ematologi con formazione specifica in ultrasonografia ematologica.
Tra i 13 pazienti iwCLL-CR ma US-HD-PR, un paziente presentava esclusivamente una residua alterazione splenica e non una residua alterazione linfonodale. Poiché l'analisi esplorativa successiva era finalizzata a caratterizzare il fenotipo del linfonodo residuo, questo paziente è stato escluso soltanto dalla sottoanalisi nodale. Il gruppo candidato RUD comprende quindi 12 pazienti.
Un altro elemento metodologico rafforza questa analisi: in tutti i 12 casi il linfonodo studiato alla migliore risposta era lo stesso linfonodo target identificato al baseline. Non stiamo quindi confrontando linfonodi diversi scelti in momenti differenti, ma osservando longitudinalmente il rimodellamento della stessa struttura anatomica durante il trattamento.
Il risultato forse più interessante dell'analisi longitudinale è che i linfonodi candidati RUD mostrano una risposta terapeutica evidente. Dal baseline alla migliore risposta diminuiscono significativamente sia l'asse lungo sia l'asse corto; diminuisce inoltre il rapporto short/long, indicando un vero rimodellamento geometrico verso una configurazione relativamente più allungata.
Il confronto con i controlli US-HD-CR rafforza questo concetto. La riduzione percentuale dell'asse lungo e dell'asse corto non differiva significativamente tra i due gruppi. I linfonodi RUD rimanevano tuttavia dimensionalmente più grandi alla migliore risposta e mostravano una variazione longitudinale del rapporto short/long più marcata. La RUD candidata non sembra quindi coincidere banalmente con una mancata riduzione dimensionale: rappresenta piuttosto la persistenza di un fenotipo ecografico incompleto dopo un rimodellamento tissutale sostanziale.
Tutti i 12 linfonodi candidati RUD presentavano reticolatura corticale, forma ovale e ilo ecogeno visibile; il Doppler era prevalentemente ilare, con pattern misto in tre casi. La reticolatura risultava molto meno frequente nei controlli US-HD-CR.
Questo dato inizialmente poteva apparire come il principale “marcatore” della RUD, ma una revisione metodologica più rigorosa impone cautela. La reticolatura corticale faceva già parte dei parametri utilizzati per assegnare la risposta multiparametrica US-HD. Confrontare successivamente la sua frequenza tra RUD e controlli US-HD-CR introduce quindi un incorporation bias, cioè una componente di circolarità. Per questo motivo la reticolatura deve essere descritta come caratteristica ricorrente del fenotipo candidato, non come marcatore indipendentemente validato.
Il dato centrale diventa la coesistenza di marcato rimodellamento dimensionale e geometrico con persistenza di alterazioni multiparametriche, evitando di ridurre la RUD a una singola caratteristica ecografica.
Poiché la terapia con BTKi è continuativa, era importante escludere che il gruppo RUD fosse semplicemente stato osservato “troppo presto”. La mediana del tempo alla migliore risposta US-HD era 26,7 mesi nei candidati RUD e 18,9 mesi nei controlli US-HD-CR. Non è emersa evidenza di una differenza significativa (p=0,840).
Il risultato rende meno probabile che le differenze osservate siano spiegate soltanto da una valutazione sistematicamente più precoce dei RUD. Tuttavia, con 12 pazienti per gruppo e un intervallo di confidenza ampio, non è corretto affermare che i tempi siano equivalenti. Il dato va quindi considerato rassicurante rispetto a un potenziale bias temporale, ma non definitivo.
Il termine RUD viene proposto come concetto esplorativo di imaging. Non significa MRD e non significa automaticamente persistenza di LLC vitale. L'MRD misura cellule leucemiche residue in un campione biologico, tipicamente sangue periferico o midollo; l'US-HD descrive invece la struttura di un compartimento tissutale. Sono livelli diversi di osservazione.
Un linfonodo ecograficamente alterato dopo terapia potrebbe contenere cellule leucemiche residue, ma potrebbe anche riflettere rimodellamento stromale, fibrosi, modificazioni della rete linfatica o vascolare, oppure una combinazione di questi fenomeni. Senza istologia o un altro reference standard indipendente, lo studio non può risolvere questa domanda. Proprio per questo la RUD viene proposta come “candidate residual imaging phenotype” e non come equivalente ecografico della malattia minima residua.
La tesi propone quindi di andare “beyond dimensional response” senza mettere in discussione il ruolo centrale dei criteri iwCLL. L'US-HD multiparametrica permette di osservare il linfonodo come tessuto che cambia nel tempo, non soltanto come diametro. Nei pazienti trattati con BTKi continuativo, una quota non trascurabile di risposte complete secondo iwCLL mantiene alterazioni ecografiche residue; queste alterazioni sono particolarmente frequenti nei compartimenti superficiali e possono persistere nonostante una marcata riduzione dimensionale e un significativo rimodellamento geometrico.
La Residual Ultrasound Disease rappresenta, allo stato attuale, un'ipotesi di lavoro: un fenotipo tissutale residuo ecograficamente riconoscibile e potenzialmente riproducibile, il cui significato biologico e clinico deve ancora essere dimostrato. È proprio questa domanda aperta — più che una conclusione definitiva — a costituire il principale valore scientifico e la prospettiva di sviluppo del progetto.