ETD

• Eruca sativa
• Microbiota intestinale
• Modelli in vitro
• Potenziale biologico
• Vescicole extracellulari

I prebiotici, ossia substrati alimentari che favoriscono selettivamente la crescita di alcune specie microbiche rispetto ad altre, sono uno strumento nutraceutico molto utilizzato per preservare o ripristinare l’equilibrio del microbiota intestinale, che ha un ruolo fondamentale nella salute umana e nella patogenesi di diverse malattie. Le vescicole extracellulari derivate da alcune piante commestibili contengono composti bioattivi in grado di esercitare effetti locali e sistemici, in alcuni casi mediati da proprietà antimicrobiche e/o prebiotiche. Ad esempio, le vescicole derivate dalle foglie di Eruca sativa (arugula leaf vesicles, ALV) sono note per possedere effetti antiossidanti, ipoglicemizzanti, antitumorali e antinfiammatori, ma non sono ancora state caratterizzate per le loro proprietà anti- e/o prebiotiche. Nel presente progetto di tesi è stata valutata l’attività antimicrobica e prebiotica in vitro di ALV su singole specie microbiche e la sua capacità di modulare comunità complesse, da sole o in co-somministrazione con un ceppo probiotico, utilizzando un modello in vitro di microbiota intestinale umano (3DM-IVM).
Le ALV sono state inizialmente utilizzate in saggi di microdiluizione in brodo per valutarne l’attività antimicrobica contro un pannello di batteri e funghi. In seguito, diverse concentrazioni di ALV sono state introdotte nel modello in vitro 3DM-IVM. Al termine dell’incubazione nel modello in presenza o assenza del trattamento con ALV, la biomassa del biofilm formato dal microbiota è stata quantificata tramite saggio del cristalvioletto e le colture sono state sottoposte ad estrazione del DNA genomico. La composizione della comunità microbica è stata valutata tramite Real-Time PCR quantitative (qPCR). L’attività prebiotica di ALV è stata testata su diverse specie batteriche effettuando curve di crescita, permettendo di valutarne l’effetto sulla crescita complessiva e sul tempo di generazione in fase esponenziale. Infine, il modello 3DM-IVM è stato nuovamente utilizzato per testare l’effetto della co-somministrazione del ceppo probiotico E. faecium NCIMB 10415 e ALV sulla composizione della comunità microbica tramite Real-Time qPCR.
Le ALV non hanno mostrato attività antimicrobica contro nessuno dei ceppi saggiati, né capacità di modulare la biomassa del biofilm formata dal microbiota intestinale in vitro. I risultati delle Real-Time qPCR hanno mostrato un decremento di Akkermansia e un incremento di Enterococcus a seguito del trattamento con ALV rispetto al microbiota non trattato. Le curve di crescita di E. faecalis ATCC 29212 ed E. faecium NCIMB 10415 hanno mostrato un aumento della crescita batterica e una riduzione del tempo di generazione in presenza di ALV rispetto al controllo non trattato. Al contrario, non sono state evidenziate influenze significative sulla crescita degli altri ceppi analizzati, indicando un effetto prebiotico specifico verso Enterococcus e confermando così quanto osservato nei primi esperimenti nel modello di microbiota. Gli esperimenti di co-somministrazione di ALV e del ceppo probiotico di E. faecium sono ancora in corso e permetteranno di verificare se la somministrazione del sinbiotico avrà un impatto maggiore sulla composizione del microbiota rispetto al probiotico e al prebiotico somministrati singolarmente.
In conclusione, l'assenza di attività antimicrobica delle ALV ne favorisce l'impiego sicuro come prebiotico, confermando che il composto non altera indiscriminatamente le specie microbiche. La loro introduzione nel modello in vitro di microbiota intestinale umano ha mostrato un effetto di modulazione contenuto anche ad elevate concentrazioni; questo indica che le ALV non stravolgono l'intero ecosistema, ma agiscono in modo altamente selettivo. Questa specificità d'azione è stata confermata dallo studio delle curve di crescita, che ha evidenziato un'attività prebiotica mirata verso il genere Enterococcus. Questo promettente risultato ha posto le basi per la seconda fase del progetto, attualmente in corso, focalizzata sulla co-somministrazione di ALV con il ceppo probiotico E. faecium NCIMB 10415 per valutarne l'efficacia come sinbiotico.