• additive manufacturing
• biodegradable polymers
• bone tissue
• cell differentiation
• differenziamento cellulare
• Ingegneria tissutale
• manifattura additiva
• polimeri biodegradabili
• scaffold
• scaffold
• tessuto osseo Tissue engineering

L’aumento dell’insorgenza di fratture e difetti ossei causati da traumi, malattie croniche, malformazioni congenite e patologie oncologiche rappresenta una crescente sfida per la salute globale, con un impatto significativo sia sulla qualità della vita dei pazienti che sul sistema sanitario.
Per promuovere la rigenerazione del tessuto osseo danneggiato, sono state sviluppate diverse strategie di ingegneria tissutale, che costituiscono valide alternative alle limitazioni terapeutiche e metodologiche associate al trapianto d’organo e alla ricostruzione chirurgica. Queste tecnologie si basano sull’impiego di scaffold, strutture tridimensionali (3D) porose, biocompatibili e biodegradabili che, fornendo un supporto fisico alle cellule, ne favoriscono l’adesione, la proliferazione e il differenziamento verso un fenotipo osteogenico. Nel campo dell’ingegneria tissutale ortopedica, il poli(e-caprolattone) (PCL), un poliestere alifatico sintetico semicristallino approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e dalla European Medicines Agency (EMA), ha suscitato particolare interesse per la sua biodegradabilità, biocompatibilità, adeguate proprietà meccaniche e ottima processabilità, sia allo stato fuso che in soluzione, che ne consentono la modellazione in diverse forme con porosità controllata.
Nel presente lavoro di tesi, il PCL è stato impiegato per la fabbricazione di scaffold polimerici caricati con b-fosfato tricalcico (b-TCP) in concentrazione del 5 o 10 wt%, al fine di valutare se l’inclusione della ceramica bioattiva potesse potenziare la rigenerazione ossea rispetto al caso di scaffold a base di solo PCL. La b-TCP è, infatti, una ceramica biodegradabile nota per le sue proprietà osteoinduttive e osteoconduttive.
Gli scaffold sono stati fabbricati mediante Computer-Aided-Wet-Spinning (CAWS), una tecnica di manifattura additiva che prevede l’estrusione di una soluzione polimerica in un bagno di coagulazione e la deposizione controllata della fibra polimerica risultante mediante un processo strato su strato. Questa tecnologia consente di ottenere strutture 3D con una geometria definita, un’elevata porosità e interconnessione dei pori, caratteristiche fondamentali per il successo dei processi di integrazione e rigenerazione tissutale.
Un requisito fondamentale degli scaffold per applicazioni ossee è la biodegradabilità, che consente la graduale sostituzione del materiale sintetico con nuovo tessuto osseo. Per avere una visione a lungo termine del comportamento degradativo degli scaffold in condizioni fisiologiche, è attualmente in corso uno studio di degradazione in PBS (Phosphate Buffered Saline) a 37 °C e pH=7.4. Poiché il PCL presenta un lento processo di degradazione idrolitica, il quale può richiedere fino a 2-3 anni per il suo completo assorbimento in vivo, è stato inoltre adottato un protocollo di degradazione accelerata mediante incubazione in una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 50 mM per 28 giorni. A specifici intervalli temporali, gli scaffold sono stati sottoposti a diverse analisi, tra cui quantificazione della massa residua %, caratterizzazione morfologica mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), caratterizzazione meccanica mediante test in compressione, caratterizzazione termica mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC) e analisi del peso molecolare del polimero mediante cromatografia a esclusione dimensionale (SEC).
Parallelamente è stata eseguita una caratterizzazione biologica in vitro degli scaffold, utilizzando la linea cellulare di pre-osteoblasti murini MC3T3-E1. È stata completata l’ottimizzazione del protocollo di semina cellulare per massimizzare il numero di cellule adese sullo scaffold rispetto a un controllo, rappresentato da cellule seminate direttamente sulla superficie del pozzetto di polistirene trattato per coltura cellulare (tissue culture polystyrene, TCPS). I parametri di semina ottimizzati sono stati impiegati in studi a lungo termine (5 settimane) per valutare l’effetto del caricamento della β-TCP sulla deposizione della matrice minerale mediante il saggio Alizarin Red, il quale consente di quantificare i depositi di calcio.
È stata inoltre indagata la deposizione del collagene, uno dei componenti principali della matrice extracellulare (ECM), mediante il saggio Sirius Red/Fast Green. Infine, per valutare il differenziamento osteogenico indotto dagli scaffold, è stata analizzata mediante qRT-PCR l’espressione genica di marcatori specifici quali RUNX2, osteocalcina (OCN) e fosfatasi alcalina (ALP).
The increasing incidence of fractures and bone defects caused by trauma, chronic diseases, congenital malformations, and oncological pathologies represents a growing challenge for global health, with a significant impact both on patients’ quality of life and on healthcare systems.
To promote the regeneration of damaged bone tissue, several tissue engineering strategies have been developed, representing valid alternatives to the therapeutic and methodological limitations associated with organ transplantation and surgical reconstruction. These technologies rely on the use of scaffolds, i.e., three-dimensional (3D), porous, biocompatible, and biodegradable structures that, by providing physical support to cells, promote their adhesion, proliferation, and differentiation toward an osteogenic phenotype. In the field of orthopedic tissue engineering, poly(ε-caprolactone) (PCL), a semicrystalline synthetic aliphatic polyester approved by the Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA), has attracted considerable interest due to its biodegradability, biocompatibility, suitable mechanical properties, and excellent processability, both in the molten state and in solution. These features enable its processing into various shapes with controlled porosity.
In this thesis, PCL was employed for the fabrication of polymeric scaffolds loaded with β-tricalcium phosphate (β-TCP) at concentrations of 5 or 10 wt%, in order to evaluate whether the inclusion of this bioactive ceramic could enhance bone regeneration compared to pure PCL scaffolds. β-TCP is a biodegradable ceramic well known for its osteoinductive and osteoconductive properties.The scaffolds were fabricated using Computer-Aided Wet Spinning (CAWS), an additive manufacturing technique based on the extrusion of a polymeric solution into a coagulation bath, followed by the controlled deposition of the resulting polymeric fiber through a layer-by-layer process. This technology enables the production of 3D scaffolds with well-defined geometry, high porosity, and pore interconnectivity — key features for the success of tissue integration and regeneration processes. A fundamental requirement for scaffolds intended for bone applications is biodegradability, which allows the gradual replacement of the synthetic material with new bone tissue. To obtain a long-term overview of the degradation behavior of the scaffolds under physiological conditions, a degradation study in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C and pH 7.4 is currently being conducted. Since PCL undergoes a slow hydrolytic degradation process, which may take up to 2–3 years for complete resorption in vivo, an accelerated degradation protocol was also adopted, consisting of incubation in 50 mM sodium hydroxide (NaOH) for 28 days. At selected time points, scaffolds were subjected to several analyses, including residual mass quantification (%), morphological characterization by scanning electron microscopy (SEM), mechanical testing under compression, thermal characterization by differential scanning calorimetry (DSC), and analysis of the molecular weight of the polymer by size exclusion chromatography (SEC). In parallel, an in vitro biological characterization of the scaffolds was carried out using the murine pre-osteoblast cell line MC3T3-E1. The cell seeding protocol was optimized to maximize the number of cells adhering to the scaffold compared to a control represented by cells seeded directly onto the surface of tissue culture-treated polystyrene (TCPS) wells. The optimized seeding parameters were then applied in long-term (5-week) studies to assess the effect of β-TCP loading on matrix mineralization, evaluated by Alizarin Red staining, which enables the quantification of calcium deposits. Collagen deposition, one of the main components of the extracellular matrix (ECM), was also investigated using the Sirius Red/Fast Green assay. Finally, to evaluate osteogenic differentiation induced by the scaffolds, gene expression of specific markers, including RUNX2, osteocalcin (OCN), and alkaline phosphatase (ALP), was analyzed by qRT-PCR.