• itraconazolo

L'itraconazolo è un farmaco ad attività fungistatica che ha come target principale l'enzima 14α-lanosterolo demetilasi (CYP51) coinvolto nelle cellule di mammifero nella biosintesi del colesterolo, mentre nei funghi è responsabile della sintesi dell’ergosterolo. Il colesterolo è un componente essenziale delle membrane cellulari ed è presente in regioni altamente specializzate per la ricezione e trasduzione dei segnali dall'esterno, denominate lipid raft. Da tempo è nota l'azione morfogena dell’itraconazolo sul lievito patogeno Candida albicans, nel quale le strutture ifali risultano inibite. Recentemente è stato dimostrato che l'itraconazolo ha un effetto inibitorio sulla angiogenesi. La neoangiogenesi consiste nella formazione di nuovi vasi sanguigni sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Il farmaco, sia in vitro che in vivo, è in grado di inibire la formazione di strutture tubulari da parte delle cellule endoteliali, impedendo di conseguenza la formazione di una rete vascolare di particolare importanza in patologie come diabete e tumori.
Inoltre è stato dimostrato inibire direttamente la progressione di alcuni tumori e di modificare la morfologia di macrofagi murini, cellule endoteliali e dermatofiti. L'itraconazolo sembra pertanto avere un’azione morfogena aspecifica non ancora caratterizzata. Poiché la struttura morfologica è particolarmente importante nella formazione della rete neuronale, in questo lavoro di tesi abbiamo studiato l'effetto dell’itraconazolo sulle cellule nervose. Lavorando su cellule nervose embrionali di topo, tramite osservazione al microscopio abbiamo riscontrato una riduzione della lunghezza dell'assone nei campioni trattati con il farmaco, rispetto al controllo non trattato. Per mezzo di RT-PCR, abbiamo valutato le variazioni di espressioni di geni marcatori di migrazione e differenziamento cellulare quali: Nestina, N-cam, Actina, GFAP e NF-L. L’espressione genica della Nestina, marcatore dei precursori neuronali, risulta invariata; quella della molecola di adesione N-cam sembra calare in seguito al trattamento, facendo pensare a una perdita di connessioni tra le cellule, così come anche l’ espressione dell’ Actina, diminuisce in seguito a trattamento. L’espressione di NF-L e di GFAP, che codificano per i filamenti intermedi citoscheletrici e sono entrambi marcatori dello stadio differenziativo, risulta down-regolata dal farmaco, evidenziando un'azione sulla morfologia. E' stato dimostrato che l'effetto inibitorio dell’ itraconazolo agisce anche a livello del pathway mTOR/AKT, coinvolto nel processo differenziativo, bloccando la fosforilazione della proteina p70S6K da parte di mTOR, sensore del colesterolo intracellulare. Abbiamo verificato questa inibizione attraverso western blot, osservando una diminuzione della proteina p70S6K fosforilata nei campioni trattati con il farmaco. Poiché da lavori precedenti è emerso che il pathway di Sonic Hedgehog è anch’esso inibito da itraconazolo e poiché è stata riscontrata su cellule di adenocarcinoma umano un’interazione tra il pathway di mTOR e quello di Shh, siamo andati a valutare come varia la espressione dei componenti del pathway di Shh, ritrovato attivo anche nelle cellule nervose. Dai nostri risultati è emerso che l’espressione genica di Shh rimane invariata così come quella di Ptch e di Smo, mentre quella di Gli-1 cala in seguito a trattamento. Allo scopo di capire l'effetto dell'itraconazolo sui recettori di Hedgehog e il suo contributo nel traffiking del colesterolo, abbiamo valutato in parallelo ceppi di S. cerevisiae, ingegnerizzati con hSmo e hPtch, riscontrando un rallentamento della crescita più o meno consistente in seguito all’aggiunta di itraconazolo nel mezzo crescita. I nostri risultati oltre a dimostrare che anche sui neuroni l'traconazolo esercita un'azione morfogena, vanno nella direzione di capire se l'itraconazolo, bloccando il processo di differenziamento cellulare, è un farmaco adatto per la cura tumorale, la quale agisce efficacemente su cellule totalmente differenziate.