• composti tiofenici
• CYP450
• enzimi antiossidanti
• glucosinolati
• Nrf2

Negli ultimi anni si è osservato un notevole aumento del numero di persone colpite da diabete, malattie cardio-circolatorie e neoplasie maligne dovuto principalmente all'invecchiamento della popolazione e all'adozione di stili di vita non salutari sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo. Studi epidemiologici hanno accertato che diete ricche di alimenti di origine vegetale contribuiscono a prevenire parte delle malattie cardio-vascolari e molti tipi di cancro. Particolarmente interessanti in tal senso appaiono molte verdure appartenenti alla famiglia delle Brassicacee. Buona parte dell'attività protettiva esercitata da questi vegetali sembra essere attribuibile all'alto contenuto di glucosinolati (GLs). Essi da soli esibiscono bassa bioattività, ma una volta idrolizzati dalle mirosinasi (sistemi enzimatici presenti anche nella flora intestinale), danno origine agli isotiocianati (ITCs). Essi inducono enzimi antiossidanti, tramite l'attivazione del recettore Nrf2, e del metabolismo degli xenobiotici.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di investigare gli effetti di un estratto idroalcolico di Brassicacee contenente diversi glucosinolati sui suddetti enzimi, utilizzando come modello epatociti primari di ratto.
Le condizioni di coltura messe a punto prevedevano un doppio strato di collagene ed un periodo di 48 ore di incubazione a 37°C precedente al trattamento, in modo da permettere alle cellule di ripristinare le condizioni di interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare. Come controllo positivo è stato usato il glucosinolato glucorafanina (GRA) che dà origine al potente sulforafano. Inizialmente soluzioni di glucorafanina 2mM e di estratto idroalcolico di Brassicacee 2mM sono state incubate a 37°C per 15 minuti con mirosinasi 28U/ml affinchè si verificasse la reazione che porta alla liberazione del sulforafano e degli altri isotiocianati. Successivamente queste soluzioni sono state utilizzate per il trattamento degli epatociti alle concentrazioni 20μM, 40μM e 60μM, sia per 24h che per 48h.
Gli epatociti sono stati poi raccolti ed utilizzati per l'estrazione dei nuclei che sono serviti per esperimenti di Immunoblotting con lo scopo di studiare l'attivazione di Nrf2. Una seconda frazione di cellule è stata usata per l'estrazione dell'RNA totale, che è stato poi retrotrascritto ed utilizzato per esperimenti di RT-PCR qualitativa usando primer specifici per l'amplificazione dei geni DT-diaforasi ed eme-ossigenasi1.
Inoltre, su frazioni microsomiali e citosoliche sono stati effettuati saggi biochimici di fase 1 (DT-diaforasi), di fase 2 (glutatione-S-transferasi) ed antiossidanti (catalasi, glutatione reduttasi ed eme-ossigenasi). Infine, sulla frazione microsomiale, è stato effettuato un esperimento di Immunoblotting con anticorpi anti-eme-ossigenasi.
Il trattamento con l’estratto di Brassicacee, precedentemente idrolizzato con la mirosinasi, ha evidenziato un’attivazione di Nrf2, ed una sua conseguente traslocazione nel nucleo. Gli esperimenti di RT-PCR hanno mostrato un’induzione a livello trascrizionale della DT-diaforasi e dell’eme-ossigenasi dovuta al trattamento con estratto di Brassicacee. Parallelamente si è osservata un’induzione a livello catalitico sia della DT-diaforasi che dell’eme-ossigenasi. Inoltre il trattamento con l’estratto ha provocato un aumento dell’attività specifica della glutatione-S-transferasi, della catalasi, e della glutatione reduttasi. In generale, i risultati hanno mostrato un comportamento paragonabile a quello ottenuto in seguito a trattamento con sulforafano.
Attualmente sono in corso esperimenti per saggiare gli effetti su alcune attività enzimatiche dipendenti dal citocromo P450.