• 5-fluorouracil
• fosforilazione di H2AX
• H2AX phosphorylation
• HCT116
• irinotecan
• micronucleus test
• oxaliplatin
• paclitaxel
• test del micronucleo

Il cancro colorettale è uno dei tumori più diagnosticati al mondo, sia nelle donne che negli uomini. Ha una letalità molto alta, di circa 900 000 morti all’anno. L’incidenza della malattia varia geograficamente, i tassi più alti sono registrati nei paesi industrializzati. La prognosi è relativa allo stadio del tumore, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 90%, se diagnosticato in stadi iniziali, e inferiore al 10% se sono già presenti metastasi. Intervenire chirurgicamente rimuovendo il tumore risulta la miglior soluzione per curare il paziente, tuttavia, trattamenti chemioterapici sono necessari per ridurre il rischio di metastasi. I farmaci maggiormente impiegati per la cura del cancro colorettale sono il 5-fluorouracile, l’oxaliplatino, l’irinotecan e il paclitaxel.
Il 5-fluorouracile esercita all’interno della cellula tumorale diverse funzioni, tra cui essere riconosciuto nei processi di biosintesi del DNA ed essere quindi inserito nel DNA in crescita, grazie alla sua forma chimica, provocando l’arresto dei processi replicativi.
L’oxaliplatino, similmente al cisplatino, forma degli addotti DNA-platino portando alla generazione di double strand breaks (DSBs) e/o attivando la via apoptotica.
L’irinotecan è un derivato sintetico della camptotecina. È in grado di inibire la Topoisomerasi I, enzima essenziale nei processi di replicazione e/o trascrizione del DNA, portando alla formazione di DSBs permanenti e quindi a morte cellulare.
Il paclitaxel è un farmaco anti-tumorale di origine naturale, che viene estratto dall’albero Taxus brevifolia. Il farmaco promuove la formazione di microtubuli eccessivamente stabili, impedendone la dissociazione, arrestando quindi la crescita delle cellule cancerose.
Questo lavoro di tesi ha come obiettivo quello di valutare l’effetto genotossico dei sopra citati farmaci su due linee cellulari di cancro al colon-retto: la linea HCT116TP53+/+, che esprime la proteina P53 e la linea HCT116TP53-/-, che non esprime la proteina P53.
Il danno genotossico è stato valutato mediante il test del micronucleo che permette di andare ad analizzare cellule contenenti micronuclei, i quali sono un’indicazione di danno cromosomico. Nel caso in cui non si è verificata induzione di micronuclei, è stata ricercata la presenza di danni primari, più precisamente di DSBs, attraverso il saggio dei foci γ-H2AX.
Studi precedenti hanno analizzato, attraverso saggi di vitalità cellulare, l’effetto citotossico che i chemioterapici e, anche, mutageni ambientali, hanno sulle linee cellulari utilizzate. In questo lavoro di tesi, la proliferazione cellulare è mantenuta, utilizzando delle dosi di chemioterapici non citotossiche, in modo da mettere in evidenza gli effetti dei farmaci che si manifestano con danni al DNA, che possono essere danni primari, e quindi riparabili, come la fosforilazione dell’istone H2AX, oppure danni permanenti, come la formazione di micronuclei. Permettendo alle cellule di proliferare, il danno genotossico è trasmesso alle cellule “figlie” che originano a seguito della divisione cellulare e ci consentono di visualizzare gli effetti dei chemioterapici anche nelle cellule delle generazioni successive.
Trattando le due linee cellulari con quattro dosi crescenti, non citotossiche, di ciascun farmaco si può quindi evidenziare: 1) come il diverso meccanismo d’azione dei chemioterapici induca un’espressione differenziale del danno al DNA e 2) se la presenza o l’assenza di P53 sia un fattore che incide sulla sensibilità delle due linee cellulari.
I risultati ottenuti mostrano che tre dei chemioterapici utilizzati causano, in entrambe le linee cellulari, un aumento del danno genomico (in termini di micronuclei). Non sono state evidenziate differenze nella risposta allo stimolo genotossico tra due linee cellulari.
Colorectal cancer is one of the most diagnosticated tumor worldwide, both in women and men. It has a very high lethality, counting nearly 900 000 deaths per year. Its incidence varies geographically, with higher rates recorded in developed countries. The prognosis is related to the cancer stage, with a 5 year survival rate of 90% at early diagnosis and less than 10% when metastases develop. Surgical removal of the tumor is still the best option, however, chemotherapy treatments remain necessary to reduce the risk of metastases formation. The drugs most commonly used to treat colorectal cancer are 5-fluorouracil, oxaliplatin, irinotecan and paclitaxel.
5-fluorouracil plays different roles inside the cancerous cell, one of which is being recognized by the replication processes and being incorporated into new DNA strands, thanks to its particular chemical structure, and therefore causing the cell cycle arrest.
Oxaliplatin, similarly to cisplatin, binds to the DNA producing DNA-platinum adducts leading to the creation of double strand breaks (DSBs) and/or triggering apoptosis.
Irinotecan is a synthetic camptothecin-derived drug. It is capable of inhibiting Topoisomerase I, an essential enzyme in DNA replication and transcription processes, leading to permanent DSBs and thus cell death.
Paclitaxel is a natural anti-tumor drug extracted from the Taxus brevifolia tree. This drug promotes the formation of excessively stable microtubules that are not able to dissociate, thereby halting the growth of cancer cells.
This thesis aims to evaluate the genotoxic effect of the aforementioned chemotherapeutic drugs on two colorectal cancer cell lines: HCT116TP53+/+ expressing P53 protein and HCT116TP53-/- which does not express P53 protein.
Genotoxic damage was assessed with the micronuclei assay, as an indicator of chromosomal damage, and, when necessary, with the γ-H2AX foci test, which detects the presence of DSBs.
Previous studies analyzed, through cell viability assays, the cytotoxic effects of chemotherapy drugs and environmental mutagens on these cell lines. In this thesis work, cell proliferation is maintained using non-cytotoxic doses of anti-tumoral agents, in order to highlight the effects of drugs that cause DNA damage, which can be either primary and therefore repairable, such as the phosphorylation of H2AX histone, or permanent damage, such as the formation of micronuclei. By allowing the cells to proliferate, genotoxic damage is passed to daughter cells that originate from the cellular division of such cells and allows us to evaluate the effects of the chemotherapeutic agents in the following generations of cells.
Treating the two cell lines with four increasing non cytotoxic doses of each drug it is possible to evaluate: 1) how the different mechanism of action of the chemotherapy drugs induces a differential expression of DNA damage and 2) whether the presence or the absence of P53 protein is a potential factor affecting the two cell lines sensitivity.
Results show that three out of four of the drugs used caused an increase of genotoxic damage (in terms of micronuclei) in both colorectal cancer cell lines. No differences in the response to the genotoxic treatment were highlighted between the two cell lines.