ETD

• Aptameri
• Fn3
• Mesotelina

Mesothelin (MSLN) is a cell-surface glycoprotein overexpressed in various aggressive malignancies, making it a primary target for diagnostic and therapeutic applications. This thesis explored and optimized two distinct molecular strategies for the specific recognition of MSLN for theranostic purposes: the development of an engineered variant of the Fn3 protein scaffold and the establishment of a protocol for selecting single-stranded oligonucleotide ligands (aptamers).
The first part of the study focused on producing the Fn3-Y protein variant. Based on computational predictions aimed at enhancing binding affinity for MSLN compared to the parental Fn3 5.3.2 variant, the Tyr amino acid substitution was introduced via site-directed mutagenesis. Binding affinity was subsequently evaluated using flow cytometry assays on the MSLN-overexpressing mesothelioma cell line MSTO-211H (clone C7). Dose-response analysis using a four-parameter logistic regression model revealed a dissociation constant (KD) of 282.46 ± 23.55 nM for Fn3-Y, compared to a KD of 4.84 ± 0.45 nM for the 5.3.2 variant; this indicated a marked loss of binding affinity, contrary to the predictions of the theoretical models.
The second part of the work involved developing a protocol to generate a library of single-stranded DNA (ssDNA) aptamers for selection via the SELEX method. The approach relied on establishing a two-step sequential PCR amplification strategy combined with the selective digestion of the phosphorylated complementary strand. Optimizing the reaction conditions enabled an optimal yield of the labeled pool.
The generated library underwent an initial round of SELEX selection against resin-immobilized recombinant MSLN-His protein. Flow cytometric analysis of the enriched library revealed a binding level of 4.76% on MSLN-overexpressing MSTO C7 cells, compared to 1.82% observed on the wild-type cell line.
In conclusion, although S76Y site-directed mutagenesis showed limitations regarding the optimization of the Fn3 scaffold, the methodology developed for preparing and selecting the aptamer library proved effective and reproducible, laying the groundwork for subsequent SELEX enrichment rounds and the characterization of new high-affinity aptamers for MSLN.

La mesotelina (MSLN) è una glicoproteina di superficie sovraespressa in diverse neoplasie aggressive, il che la rende un bersaglio diagnostico e terapeutico di primario interesse. In questo lavoro di tesi sono state esplorate e ottimizzate due differenti strategie molecolari per il riconoscimento specifico di MSLN a fini teranostici: lo sviluppo di una variante ingegnerizzata dello scaffold proteico Fn3 e la messa a punto di un protocollo per la selezione di ligandi oligonucleotidici a singolo filamento (aptameri).
Nella prima parte del lavoro, l'attenzione è stata focalizzata sulla produzione della variante proteica Fn3-Y. Sulla base di predizioni computazionali, volte a incrementare l'affinità di legame verso MSLN rispetto alla variante di partenza Fn3 5.3.2, è stata introdotta la sostituzione amminoacidica Tyr mediante mutagenesi sito-specifica. Tramite saggi di citofluorimetria, è stata quindi valutata l'affinità di legame sulla linea cellulare di mesotelioma MSTO-211H (clone C7) sovraesprimente MSLN. L'analisi dose-risposta tramite regressione logistica a quattro parametri ha mostrato per Fn3-Y una costante di dissociazione (KD) pari a 282.46 ± 23.55 nM, a fronte di una KD di 4.84 ± 0.45 nM registrata per la variante 5.3.2, indicativa di una marcata perdita di affinità di legame, contrariamente a quanto ipotizzato dai modelli teorici.
Nella seconda parte del lavoro, è stato sviluppato un protocollo per la generazione di una libreria di aptameri oligonucleotidici a singolo filamento (ssDNA), destinata alla selezione tramite il metodo SELEX. Il metodo si è basato sulla messa a punto una strategia di amplificazione tramite PCR a due fasi sequenziali combinata con la digestione selettiva del filamento complementare fosforilato. L'ottimizzazione delle condizioni di reazione ha consentito la resa ottimale del pool marcato.
La libreria generata è stata sottoposta ad un primo ciclo di selezione SELEX contro la proteina ricombinante MSLN-His immobilizzata su resina. L'analisi citofluorimetrica della libreria arricchita ha evidenziato una percentuale di legame del 4.76 % sulle cellule MSTO C7 sovraesprimenti MSLN, a fronte dell'1.82 % osservato sulla linea wild-type.
In conclusione, sebbene la mutagenesi sito-specifica S76Y abbia dimostrato limiti nell'ottimizzazione dello scaffold Fn3, la metodologia sviluppata per la preparazione e la selezione della libreria di aptameri si è dimostrata buona e riproducibile, ponendo le basi per i successivi cicli di arricchimento SELEX e la caratterizzazione di nuovi aptameri ad alta affinità per MSLN.