ETD

• 16S rRNA
• Autenticazione cefalopodi
• Capacità discriminante
• Copertura tassonomica
• Performance di annealing

The complexity of seafood supply chains and the susceptibility of cephalopods to species substitution highlight the need for reliable molecular tools for seafood authentication. This study evaluated the potential applicability of a mitochondrial 16S rRNA gene fragment (≈200 bp) amplified by the primer pair described by Chapela et al. (2002) for the molecular identification of cephalopod species potentially commercialized within the European Union. Through the analysis of the official commercial designation lists adopted by the 27 EU Member States, a consolidated inventory of potentially marketable species was established and used as the taxonomic framework for retrieving 16S rRNA reference sequences deposited in GenBank. Taxonomic coverage of the resulting dataset, the discriminatory power of the fragment through genetic distance analysis and Neighbor-Joining clustering based on the p-distance model with 1,000 bootstrap resampling, and primer-pair performance through in silico mismatch analysis of annealing sites were evaluated. Primer performance was subsequently validated by conventional PCR on representative species.
The study resulted in a consolidated inventory of 517 species, for which 1,262 sequences containing the complete target region were retrieved. Taxonomic coverage, calculated exclusively on sequences including the fragment amplified by the Chapela et al. (2002) primers, reached 41% (211 represented species out of 517), revealing marked heterogeneity among taxonomic groups. Genetic distance and clustering analyses demonstrated a good discriminatory capacity of the fragment across most taxa examined, although high intraspecific variability and limited separation among closely related species were observed in some groups. Mismatch analysis revealed widespread nucleotide substitutions within primer annealing sites; however, these did not compromise the successful experimental amplification of the species tested. Overall, the 16S rRNA fragment proved to be a useful molecular target for cephalopod identification and authentication, although the expansion of reference databases and the integration of complementary molecular markers may further improve taxonomic coverage and species-level resolution.

La complessità delle filiere dei prodotti ittici e la vulnerabilità dei cefalopodi ai fenomeni di sostituzione di specie richiedono strumenti molecolari affidabili per l'autenticazione dei prodotti. Il presente studio ha valutato il potenziale applicativo del frammento del gene mitocondriale 16S rRNA (≈200 bp) amplificato dalla coppia di primer descritta da Chapela et al. (2002) per l'identificazione molecolare dei cefalopodi potenzialmente commercializzabili nell'UE. Attraverso l'analisi delle liste ufficiali delle denominazioni commerciali dei 27 Stati Membri dell'UE è stato definito un elenco consolidato delle specie potenzialmente commerciabili, utilizzato come base tassonomica per il reperimento delle sequenze di riferimento del gene 16S rRNA depositate in GenBank. Sono state valutate la copertura tassonomica del dataset ottenuto, la capacità discriminante del frammento mediante analisi delle distanze genetiche e clusterizzazione Neighbor-Joining su modello p-distance con 1000 bootstrap re-sampling e la performance della coppia di primer attraverso analisi in silico dei mismatch nei siti di annealing, successivamente verificata mediante PCR convenzionale su specie rappresentative.
Lo studio ha consentito di definire un elenco consolidato di 517 specie, per le quali sono state recuperate 1.262 sequenze contenenti integralmente la regione target. La copertura tassonomica del dataset, riferita esclusivamente alle sequenze comprendenti il frammento amplificato dai primer di Chapela et al. (2002), è risultata pari al 41% (211 specie su 517), evidenziando una marcata eterogeneità tra i diversi raggruppamenti tassonomici. Le analisi delle distanze genetiche e di clusterizzazione hanno mostrato una buona capacità discriminante del frammento nella maggior parte dei taxa esaminati, pur evidenziando in alcuni gruppi elevata variabilità intraspecifica e limitata separazione tra specie affini. L'analisi dei mismatch ha evidenziato la presenza diffusa di sostituzioni nei siti di annealing, senza tuttavia compromettere l'amplificazione sperimentale delle specie testate. Nel complesso, il frammento 16S rRNA si conferma un target molecolare utile per l'identificazione e l'autenticazione dei cefalopodi, sebbene l'ampliamento dei database di riferimento e l'integrazione con marcatori complementari possano contribuire a migliorarne la copertura tassonomica e la risoluzione a livello di specie.