• eccesso di zinco
• excess zinc
• in vitro
• in vitro growth
• piante transgeniche
• Populus alba
• Populus alba
• transgenic plants
• trasportatori ZIP
• ZIP transporters

Il pioppo bianco (Populus alba) per le sue caratteristiche (dimensione del genoma e suo sequenziamento, rapidità nella crescita e nello sviluppo, esteso apparato radicale, semplicità nella propagazione e trasformazione) è utilizzato come specie modello per gli studi di genetica e genomica. Nella presente tesi è stata utilizzata la specie Populus alba clone Villafranca, studiata in maniera approfondita presso i laboratori dell’Unità di Botanica del Dipartimento di Biologia e del laboratorio BioLabs della Scuola Sant’Anna mediante approcci di tipo fisiologico, biochimico, anatomico e molecolare fino alla produzione di piante transgeniche.
L’industrializzazione e l’attività dell’uomo hanno portato a un aumento dell’indice di inquinamento dell’aria, dell’acqua e del suolo. Tale inquinamento è prodotto da sostanze che danneggiano la flora e la fauna, tra cui i micro e macroelementi necessari per la crescita e la sopravvivenza della pianta. In questo studio è stato preso in esame lo zinco (Zn) che, se presente in concentrazioni superiori alla soglia fisiologica, può essere potenzialmente tossico. Studi effettuati con dosi subletali hanno dimostrato la capacità del pioppo di assorbire e tollerare elevate concentrazioni del suddetto metallo essenziale coinvolgendo anche proteine evolutivamente conservate, omologhe a quelle di piante erbacee, come ad esempio i trasportatori. Per questa ragione, oltre ad altre menzionate in precedenza, il pioppo risulta essere una delle piante modello per poter tollerare e testare gli effetti dei metalli pesanti.
Da precedenti analisi di high throughput mediante RNA-Seq è emerso che il gene UPr51, omologo per il gene ZIP1, è sovraespresso nelle radici di P. x canadensis clone I-214 trattato con dosi subletali di Zn (1 mM). Il gene sopraccitato appartiene alla famiglia dei trasportatori ZIP coinvolti nell’uptake di Zn e altri metalli, tra cui cadmio (Cd), ferro (Fe) e manganese (Mn).
In tale contesto si inserisce questa tesi magistrale con lo scopo di capire se e quale linea di Populus alba clone Villafranca, sovraesprimente le due isoforme identificate del gene UPr51, abbia performance migliori rispetto al pioppo wild-type in termini di assorbimento, traslocazione e stoccaggio dello Zn e tolleranza da esso.
Le linee transgeniche di Populus alba clone Villafranca sono state realizzate per sovraesprimere sotto il controllo del promotore costitutivo CaMV35S le due isoforme del gene ZIP1: la ZIP1;1 e la ZIP1;2.
In primis, sono state caratterizzate le nove linee transgeniche di Populus alba ottenute dalla trasformazione con Agrobacterium tumefaciens: quattro per la isoforma 1 e cinque per la isoforma 2. Per ciascuna linea sono stati studiati i livelli di espressione dei geni e il numero di copie integrate eseguendo una quantificazione tramite tecniche di Real-Time qPCR. Una volta individuata la linea maggiormente espressa per ciascuna isoforma del gene in studio, piante di pioppo sono state messe in coltura in vitro per due mesi utilizzando come terreno di crescita il WPM (McCown’s woody plant medium) contenente una dose subletale di zinco (1 mM di ZnSO4). Al termine del periodo di crescita sono state eseguite sia delle analisi morfologiche (presenza di clorosi, peso della pianta, numero di foglie, numero di internodi, numero di radici, numero di foglie in senescenza e in abscissione, altezza pianta, dimensioni foglie e lunghezza radici), sia molecolari studiando l’espressione dei geni (superossido dismutasi a Cu e Zn (Cu-Zn SOD3), catalasi (CAT1), glutatione perossidasi (GPX), ascorbato perossidasi citosolico (cAPX) e glutatione S-transferasi (GST)) coinvolti nella risposta allo stress ossidativo. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli acquisiti su piante wild-type sottoposte allo stesso trattamento.

Populus alba is used as a model species for genetics and genomics studies because of its characteristics (genome size and its sequencing, rapidity in growth and development, extensive root system, simplicity in propagation and genetic transformation). The present thesis used the species Populus alba Villafranca clone, which has been studied at the Botany Unit of the Department of Biology and the BioLabs laboratory of the Scuola Sant'Anna by means of physiological, biochemical, anatomical and molecular approaches up to the production of transgenic plants.
Industrialization and human activity have caused an increase in the index of air, water and soil pollution. Such pollution is produced by substances that harm flora and fauna, including micro- and macro-nutrients necessary for plant growth and survival. This study examined zinc (Zn), which, when present in concentrations above the physiological threshold, can be potentially toxic. Studies with sublethal doses have demonstrated the ability of poplar to absorb and tolerate high concentrations of the above essential metal involving even evolutionarily conserved proteins, homologous to those of herbaceous plants, such as transporters. For this reason and other its characteristics, it appears to be one of the model plants to be able to tolerate and test the effects of heavy metals.
From previous RNA-Seq high throughput analysis the UPr51 gene was overexpressed in roots of Populus x canadensis clone I-214 treated with sublethal doses of Zn (1 mM). The previously mentioned gene belongs to the family of ZIP transporters involved in the uptake of Zn and other metals, including cadmium (Cd), iron (Fe) and manganese (Mn) and it has been found to be homologue to Populus alba ZIP1 gene.
This is the context of this master's thesis with the aim of understanding whether and which Populus alba Villafranca clone line, overexpressing the two identified isoforms of the UPr51 gene, performs better than wild-type poplar in terms of Zn uptake, translocation, storage and tolerance to it.
The transgenic lines of Populus alba Villafranca clone were designed to overexpress under the control of the constitutive CaMV35S promoter the two isoforms of the ZIP1 gene: ZIP1;1 and ZIP1;2.
Populus alba Villafranca clone has been used to produce two transgenic lines overexpressing the two isoforms of the UPr51 gene identified. Firstly, the nine transgenic lines of Populus alba (four for isoform 1 and five for isoform 2) obtained by Agrobacterium transformation were characterized. For each line, gene expression levels and integrated copy number were studied by performing Real-Time qPCR techniques. Once the most highly expressed line for each isoform of the gene under study was identified, poplar plants were cultured in vitro for two months using WPM (McCown's woody plant medium) containing a sublethal dose of zinc (1 mM ZnSO4). At the end of the growth period, morphological analysis (i.e. presence of chlorosis, plant weight, number of leaves, number of internodes, plant height, leaf size, root length) and zinc content were carried out. In addition, molecular analyses were performed, studying the expression of genes (Cu and Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD3), catalase (CAT1), glutathione peroxidase (GPX), cytosolic ascorbate peroxidase (cAPX) and glutathione S-transferase (GST)) involved in the oxidative stress response. The results were compared with those acquired on wild-type plants grown in the same condition.