• biomarcatori tumorali
• saliva
• vescicole extracellulari

L’impiego della biopsia liquida, finalizzata a identificare biomarcatori di specifica derivazione
patologica in fluidi biologici, può coadiuvare e potenzialmente anticipare la diagnosi basata su
evidenze cliniche. Le vescicole extracellulari (sistemi nanostrutturati di origine biologica, con
diametri generalmente compresi tra 50 e 200nm, generalmente definiti “small extracellular vesicles”,
SEV) possono preservare, e veicolare attraverso barriere biologiche, proteine ad acidini nucleici in
esse contenuti. Lo studio a livello molecolare di questi sistemi in ambito di diagnostica oncologica
può quindi fornire informazioni sulla presenza di stati patologici, consentendo un campionamento
direttamente derivante dal sito tumorale. L’isolamento e la purificazione di questi biomarcatori è
però ostacolata da tecniche relativamente complesse ed onerose, e la traslazione clinica di
metodiche diagnostiche basate su queste strutture è ancora poco diffusa. Tra i fluidi biologici
considerabili, la saliva è una delle più promettenti fonti di diagnosi non invasive, dato che può essere
raccolta in maniera non invasiva e presenta una composizione molecolare più semplice di quella del
plasma. Si tratta di un liquido che contiene vescicole extracellulari, la cui purificazione è tuttavia resa
complessa dalla presenza di proteine extracellulari e di mucine, che possono diluire e mascherare i
potenziali biomarcatori.
In questo ambito, il progetto di tesi sviluppato ha affrontato la tematica della saliva quale potenziale
biomarcatore tumorale in tumori pancreatici. L’obiettivo del presente studio è stato duplice. In primo
luogo, è stato testato e validato un dispositivo di purificazione basato su separazione in funzione del
diametro idrodinamico delle vescicole. Il dispositivo validato è stato usato per identificare potenziali
biomarcatori nella saliva di pazienti operandi per tumore al pancreas, al fine di mettere a punto test
semplici e non invasivi idonei a identificare i soggetti ad alto rischio tumorale e che consentano di
effettuare una diagnosi precoce.
Il dispositivo testato è stato realizzato con dei dischi rivestiti di resina epossidica, all’interno dei quali
sono state inserite membrane di varie dimensioni (0.05 um, 0.2 um, 0.4 um, 0.8 um) in grado di
separare in quattro frazioni il contenuto vescicolare del campione. Le frazioni sono state analizzate
tramite misure di DLS (tecnica che misura le singole particelle presente nel campione e le correla alla
dimensione). È stato inoltre valutato il contenuto proteico delle singole frazioni e dell’eluito, e
confermata l’assenza di proteine extravescicolari nelle frazioni.
Un’ulteriore conferma dell’efficienza del dispositivo è stata ottenuta tramite analisi mediante
elettroforesi bidimensionale delle frazioni ottenute, confrontate con l’elettroforesi della saliva intera.
I campioni così ottenuti sono stati digeriti, processati per essere analizzati in LC-MS, ed infine
analizzati tramite tecniche di proteomica top-down, per identificare le proteine contenute nelle
vescicole. L’analisi proteomica ha messo in evidenza varie proteine con un buon potenziale come
biomarcatori, suscettibili di ulteriore validazione.