• B-RAF
• claudina1 e 7
• P2X7

Il carcinoma epiteliale della tiroide è il tumore endocrino più comune e rappresenta circa l’1% dei tumori di nuova diagnosi. L’istotipo papillare (PTC) rappresenta oltre l’80% di tutti i tumori della tiroide e negli ultimi decenni la sua incidenza è significativamente aumentata. Il PTC ha generalmente una prognosi favorevole, infatti, oltre l’85% dei pazienti affetti risulta libero da malattia; tuttavia, il tasso di persistenza/recidiva può non essere trascurabile (10-15% dei casi).
Negli ultimi anni c’è stato un significativo avanzamento nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base della carcinogenesi tiroidea. I PTC sono frequentemente associati ad alterazioni genetiche che sono coinvolte nel processo di iniziazione del tumore. Le mutazioni di BRAF rappresentano l'evento genetico più comune (in particolare nelle varianti classica ed a cellule alte), risultando presenti mediamente nel 40% dei casi. In particolare, la mutazione V600E di BRAF ha ricevuto una considerevole attenzione per la possibile utilità nella stratificazione del rischio dei PTC. Dai dati in letteratura BRAF emerge come importante parametro di aggressività istologica alla diagnosi, tuttavia non è del tutto definito il suo potenziale ruolo nella stratificazione prognostica in termini di persistenza/recidiva di malattia durante il follow-up. In particolare, resta da chiarire il potenziale ruolo di BRAF nel selezionare alla diagnosi i pazienti con criteri anatomopatologici/clinici di aggressività, cioè i pazienti a più alto rischio di persistenza/recidiva, allo scopo di modularne l’atteggiamento terapeutico. A questo proposito, potrebbe diventare cruciale l’identificazione di ulteriori marcatori molecolari che possano rappresentare, in associazione alla mutazione BRAF, accurati indicatori prognostici capaci di meglio definire la stratificazione iniziale del rischio e quindi perfezionare il trattamento e personalizzare il follow-up del paziente.
Le Claudine costituiscono la principale componente delle giunzioni serrate o tight junction (TJ) tra cellule insieme alle occludine ed alle molecole di adesione. Le TJ rappresentano un network continuo di filamenti sulla superficie cellulare, regolano il passaggio di ioni e piccole molecole (funzione di “barriera”) e svolgono un ruolo cruciale per l'organizzazione della polarità dell'epitelio, per la localizzazione dei canali ionici, dei recettori e degli enzimi (funzione di “recinto”). Di recente, è stata suggerita una forte associazione tra le TJ e la carcinogenesi. Si ipotizza che la distruzione delle giunzioni serrate determini perdita di coesione, maggiore capacità di invasione e sdifferenziazione e, di conseguenza, promozione della tumorigenesi.
I dati in letteratura circa l'associazione tra carcinoma ed espressione delle CLDN non sono uniformi ed il profilo di espressione delle claudine può essere vario. In differenti tipi di carcinoma è stato riportato sia un incremento che un decremento di espressione delle CLDN. Per quanto riguarda il carcinoma tiroideo, pochi studi hanno valutato il profilo di espressione delle CLDN. Alcuni studi hanno documentato l'incremento dell'espressione genica di CLDN-1 nei PTC. In uno studio più recente, mediante tecniche di immunoistochimica, è stata descritta una cospicua espressione di CLDN-1 nei PTC e nei microcarcinomi papillari rispetto ai carcinomi follicolari ed agli adenomi, facendo emergere la CLDN-1 come possibile marcatore di PTC. In altri studi è stato descritto un diverso profilo di espressione delle CLDN-1, -4 e -7 nei diversi tipi istologici di tumore tiroideo, osservando una ridotta espressione nel carcinoma indifferenziato o scarsamente differenziato e nel carcinoma midollare. Sulla base di questa osservazione, è possibile ipotizzare una significativa correlazione tra bassa espressione delle CLDN e perdita della differenziazione cellulare.
Il segnale purinergico é coinvolto in numerosi processi biologici e l'ATP ed altri nucleotidi extra-cellulari potrebbero svolgere un ruolo nel trattamento dei carcinomi, mediante interazione con i recettori P2 (P2R). Sono stati identificati diversi sottotipi di P2R sia in colture primarie che linee cellulari di neoplasie umane. Il sottotipo P2X7R ha suscitato particolare interesse per il ruolo svolto nella crescita ed apoptosi cellulare e nel rilascio di citochine.
Sono stati descritti diversi polimorfismi del gene che codifica per P2X7R. Particolare interesse desta il polimorfismo "loss of function" 1513A>C, caratterizzato dalla sostituzione di Glu-496 con un residuo di Alanina nella porzione C-terminale intracellulare. Poichè l'apoptosi svolge un ruolo chiave nell'eliminazione delle cellule tumorali, un difetto funzionale di P2X7R potrebbe essere coinvolto nello sviluppo e diffusione tumorale. L’iperespressione di P2X7 è stata documentata in numerose neoplasie umane (leucemia linfatica cronica, neuroblastoma, melanoma, carcinoma prostatico, polmonare e intestinale).
In questo studio abbiamo valutato, per la prima volta, contemporaneamente l’espressione di CLDN-1 e -7 e la presenza del polimorfismo 1513A/C e della mutazione puntiforme V600E di BRAF in un gruppo di pazienti affetti da PTC, selezionati per la presenza alla diagnosi di rischio “moderato/alto” secondo la classificazione TNM (stadio III/IV) o “basso” (stadio I/II), ma con aspetti isto-patologici di aggressività. Obiettivo primario dello studio è stato quello di verificare il possibile ruolo di tali markers molecolari nella selezione dei pazienti con effettivo decorso clinico sfavorevole nel successivo follow-up e quindi nell’ottimizzazione precoce della stratificazione del rischio. A tale scopo abbiamo incluso 68 casi rispondenti ai nostri criteri di selezione. Alla fine del follow-up, nell’intera coorte di pazienti, circa la metà (53%) risultava libera da malattia, mentre il 47% presentava persistenza/recidiva di malattia, con 3 decessi per PTC metastatico. I nostri dati hanno confermato che, nell'intera coorte, alcuni parametri di maggior rischio (età, sesso maschile, stadio TNM, diametro, istotipo, valori di tireoglobulina prima della terapia ablativa) correlavano con una prognosi peggiore. Considerando il sottogruppo di pazienti a basso rischio TNM (stadio I/II), la persistenza/recidiva di malattia era documentata nel 26% dei casi confermando il sospetto clinico-patologico di aggressività. Peraltro, in questo sottogruppo, non si osservava alcuna correlazione tra la persistenza/recidiva di malattia ed i più tradizionali parametri prognostici sfavorevoli, confermando la peculiare necessità di markers molecolari capaci di predirne un decorso sfavorevole. Per quanto riguarda la mutazione puntiforme di BRAF abbiamo confermato l’associazione preferenziale con gli istotipi papillare variante classica ed a cellule alte, con una prevalenza particolarmente elevata (72%). Tale prevalenza (68.4%) era confermata anche nel sottogruppo dei pazienti con stadio I/II. Questo dato conferma la significativa associazione tra la mutazione di BRAF e l’aggressività anatomopatologica e clinica alla diagnosi, in accordo con i più recenti dati della letteratura. Ciononostante, in questa casistica selezionata, la mutazione BRAF V600E non risultava efficace nel selezionare i pazienti con prognosi peggiore. Infatti, un decorso clinico sfavorevole si riscontrava nel 47% dei pazienti indipendentemente dalla presenza della mutazione, per cui l’accuratezza diagnostica risultava inferiore al 50%. Analoghi risultati si ottenevano nel sottogruppo a minor rischio (stadio I/II), in cui la persistenza/recidiva di malattia risultava simile indipendentemente dalla mutazione di BRAF (rispettivamente 27% e 25%), con un’accuratezza diagnostica del 42%. In altre parole la mutazione di BRAF, pur associandosi alla presenza di indici convenzionali di aggressività alla diagnosi, non era in grado di consentire, rispetto a questi ultimi, una ulteriore selezione capace di stratificare il rischio ed il conseguente atteggiamento terapeutico, confermando la necessità di identificare ulteriori markers prognostici molecolari.
In questo contesto, abbiamo valutato il ruolo delle CLDN e del polimorfismo 1513A/C di P2X7 come possibili markers aggiuntivi per aumentare la capacità prognostica di quelli finora più studiati.
La presenza del polimorfismo 1513A/C di P2X7, sebbene correli con la variante follicolare del carcinoma papillare, tuttavia non sembra mostrare una correlazione statisticamente significativa con le caratteristiche istopatologiche.
L'espressione di CLDN-7 risultava ridotta nel 22% dei campioni di PTC dell’intera coorte ed una prevalenza analoga (21%) era osservata nel sottogruppo dei pazienti in stadio I/II. E' importante sottolineare come, a differenza di quanto osservato per la mutazione puntiforme di BRAF, la bassa espressione di CLDN-7 correlava significativamente con la persistenza/recidiva di malattia (p=0.02), con una specificità dell’89% ed un’accuratezza diagnostica del 63%. Inoltre, nel sottogruppo dei pazienti in stadio I/II, la bassa espressione di CLDN-7 era in grado di prevedere la persistenza/recidiva di malattia con una specificità ed un VPN superiori all'80% ed un’accuratezza diagnostica del 74%, avvicinandosi alla significatività statistica. Questi dati sembrano conferire al marker una particolare utilità nel predire un decorso clinico favorevole (elevato VPN) soprattutto in pazienti in cui il sistema TNM è meno efficace e la presenza di segni isto-patologici di aggressività include oltre il 75% dei casi che andranno incontro a guarigione clinica. In questo studio abbiamo confermato un incremento dell’espressione della CLDN-1 nelle sezioni istologiche principalmente della variante classica e follicolare (score 2-3), rispetto al tessuto tiroideo normale. Tuttavia, in accordo con precedenti dati della letteratura, in alcuni campioni tumorali tale incremento non era evidente (score 0-1). In dettaglio, considerando l’intera coorte di campioni, abbiamo documentato una ridotta espressione di CLDN-1 nel 40% dei campioni, soprattutto nelle varianti a cellule alte e solida. La presenza di ridotta espressione di CLDN-1 si associava ad un decorso clinico sfavorevole pur non raggiungendo la significatività statistica (p=0.08), con scarsa specificità (69%) ed accuratezza diagnostica (60%). Analoghi risultati si ottenevano analizzando il sottogruppo dei pazienti con basso grado TNM: specificità 71% e accuratezza 63%. Abbiamo infine valutato se la contestuale presenza di bassa espressione di CLDN-1 e della mutazione puntiforme BRAF V600E potesse migliorare il potere prognostico, avvicinandolo a quello della CDLN-7 da sola. La contemporanea presenza dei due marker (bassa CLDN-1 e mutazione di BRAF), mostrava una correlazione statisticamente significativa con la prognosi (p=0.04). In dettaglio, si osservava un significativo incremento della specificità (83%), a fronte di un’accuratezza diagnostica sub-ottimale (62%). Nel sottogruppo dei pazienti in stadio I la contemporanea presenza dei due markers molecolari determinava un significativo incremento della specificità (86%) e dell’accuratezza diagnostica (71%). In conclusione, in questa coorte selezionata di pazienti affetti da PTC, la prevalenza della mutazione di BRAF è risultata particolarmente elevata, confermandosi il più sensibile marcatore di aggressività istologica. Ciononostante, la presenza di mutazione BRAFV600E non risultava altrettanto sensibile come marcatore prognostico, in quanto da sola era inefficace nel selezionare i pazienti con prognosi peggiore. Abbiamo inoltre confermato una bassa espressione di CLDN-1 e -7 negli istotipi più aggressivi, documentando inoltre che tale ridotta espressione correlava con una prognosi peggiore. In particolare, la valutazione del profilo di espressione della CLDN-7 risultava efficace nel predire un decorso clinico favorevole (elevato VPN) soprattutto in pazienti in cui il sistema TNM è meno efficace (stage I-II) e la presenza di segni isto-patologici di aggressività include oltre il 75% dei casi che andranno incontro a guarigione clinica. La contemporanea valutazione della mutazione BRAF e dell’espressione di CLDN-1 era capace di conferire una efficacia simile a quella della CLDN-7.
Nell'insieme, i nostri dati suggeriscono quindi che nei pazienti con PTC a maggiore aggressività istologica (la maggior parte dei quali presenta mutazione puntiforme BRAF), la valutazione dell’espressione delle claudine, in particolare della CLDN-7, può essere utile nella stratificazione del rischio e nella definizione dell’atteggiamento terapeutico. Ulteriori studi prospettici, su ampie casistiche di pazienti e più lungo follow-up, sono comunque necessari per confermare questi dati preliminari ed individuare un pannello più ampio e completo di marcatori genetici, che al momento rappresentano la strategia più promettente nella stratificazione prognostica di questi pazienti.