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Da qualche anno a questa parte si assiste ad un forte incremento di interesse sulla crioconservazione dei gameti femminili. La crioconservazione degli ovociti rappresenta un'alternativa per utilizzare al massimo una stimolazione ovarica; è particolarmente utile per le pazienti a rischio di iperstimolazione ovarica e permette di preservare la fertilità in donne a rischio di fallimento ovarico precoce per cause genetiche, patologie pelviche, o in seguito a trattamenti chemio e radioterapici. Nel presente studio siamo andati ad analizzare l’impatto delle proprietà intrinseche cellulari nel mantenimento delle competenze biologiche dell’oocita dopo congelamento. Per raggiungere tale scopo abbiamo incentrato la nostra attenzione sull’osservazione di alcuni parametri cellulari, come la sopravvivenza morfologica, la configurazione cromosomica in metafase II, la formazione di specie reattive dell’ossigeno e i potenziali cellulari. La tecnica di crioconservazione utilizzata è stata la vitrificazione. Lo scopo del presente studio è quello di valutare nel modello murino , l'effetto dell'invecchiamento post-ovulatorio e dell'invecchiamento riproduttivo sul mantenimento delle competenze biologiche dell'ovocita sottoposto ad uno specifico protocollo di crioconservazione. Lo studio inoltre comprende anche un'applicazione clinica con la quale valutare se il protocollo di crioconservazione da noi adottato risulta efficace nella conservazione di ovociti umani. Abbiamo inoltre voluto verificare se l'esperienza dell'operatore ossia l'acquisizione della tecnica di vitrificazione influisce sulle percentuali di fertilizzazione, clivaggio e qualità degli embrioni. In questo studio abbiamo selezionato due differenti popolazioni murine appartenenti alla medesima specie: topi giovani (4-8 settimane di vita) e topi anziani (48-52 settimane di vita) entrambi sottoposti a stimolazione ormonale. Abbiamo poi suddiviso gli oociti prelevati da topi giovani in due gruppi sperimentali: oociti giovani, quelli immediatamente sottoposti a vitrificazione dopo loro isolamento e oociti invecchiati in vitro quelli incubati a 37°C con il 5 % CO2 in medium M16 (Sigma) per almeno 6 h dal loro isolamento.
Tutti i gruppi cellulari da noi esaminati hanno mostrato, sia nella fase di recupero sia dopo incubazione di 2 h, degli elevati tassi di sopravvivenza. Abbiamo dimostrato che la vitrificazione non alterava la normale distribuzione cromosomica in giovani oociti mentre provocava una loro alterata distribuzione e una riduzione del livello di condensazione della cromatina in oociti invecchiati in vitro e in oociti anziani. Dai nostri risultati è emerso che oociti giovani vitrificati mostrano lo stesso tasso di formazione dei pronuclei rispetto agli oociti giovani in assenza di trattamento; mentre per quanto riguarda oociti invecchiati in vitro e oociti anziani entrambi vitrificati si assiste inevitabilmente ad una riduzione della formazione di pronuclei rispetto a quelli non crioconservati.
Inoltre gli oociti giovani non hanno mostrato alcuna frammentazione né a fresco né dopo vitrificazione. Gli ovociti invecchiati in vitro invece, dopo crioconservazione, vanno incontro ad un incremento di circa il 20% del processo di frammentazione rispetto a quelli attivati a fresco. Gli ovociti anziani invece mostrano lo stesso tasso di frammentazione indipendentemente dal processo di crioconservazione.
Per quanto riguarda le nostre osservazioni cliniche, Il numero delle pazienti che hanno crioconservato i propri gameti nei tre anni della durata dello studio è 68 con un'età media di 33 anni. Il numero medio di ovociti congelati per paziente è 5. Abbiamo congelato 367 ovociti. Il numero di cicli di scongelamento sono stati 31. Abbiamo scongelato 123 ovociti appartenenti a 27 pazienti. Tutte le pazienti hanno trasferito embrioni ottenuti da ovociti scongelati. Sono stati microiniettati 98 ovociti (scartati 25 ovociti). Gli ovociti fertilizzati sono stati 79. Gli embrioni che hanno effettuato il clivaggio sono stati 65. La percentuale di sopravvivenza degli ovociti allo scongelamento è è risultata essere dell'80% mentre la percentuale di fecondazione dopo icsi è risultata del 79%. La percentuale di clivaggio degli embrioni da noi riscontrata è l'82%, la percentuale di gravidanza è stata del 13%. Abbiamo inoltre osservato che la percentuale degli embrioni di grado tre diminuisce significativamente dal 2011 al 2013. Il nostro studio ci ha portato a comprendere che esiste un tempo di incubazione pre-congelamento che può influire sul mantenimento delle competenze biologiche dell’oocita dopo vitrificazione.
Sebbene nel nostro studio abbiamo applicato un unico protocollo di vitrificazione, i nostri risultati possono comunque essere considerati un valido contributo per comprendere le condizioni ottimali da applicare nella routine di laboratorio nel processo di vitrificazione rivolto anche a vecchie cellule di mammifero. Nella vitrificazione che può essere considerato un metodo valido per la crioconservazione ovocitaria, la manualità e la capacità di eseguire la tecnica risultano molto importanti.