• dopamina
• diabete mellito di tipo 2
• morbo di Parkinson
• pancreatic beta cells
• insulin
• insulina
• dopamine
• type 2 diabetes mellitus
• Parkinson disease
• cellule beta pancreatiche

RIASSUNTO
INTRODUZIONE. La dopamina è un neuromediatore con ruoli importanti in diversi organi ed apparati. Svolge un’azione cruciale nel sistema nervoso, attraverso la regolazione di pathways del controllo motorio e di circuiti corticali implicati nella motivazione, nelle funzioni cognitive e riproduttive, ma ha anche svariati ruoli periferici: agisce a livello del circolo, della fisiologia del rene, del sistema gastro-enterico e della fisiologia pancreatica, esocrina ed endocrina. Nel rapporto tra pancreas endocrino e dopamina, le cellule beta sono quelle su cui la dopamina ha la maggiore influenza, pur essendoci interrelazioni anche con gli altri citotipi pancreatici.
Ultimamente, si è assistito ad un sempre maggiore interesse nei confronti dei rapporti tra alcuni farmaci antipsicotici dotati di un’azione anti-dopaminergica ed il rischio di sviluppare diabete, nonché dell’associazione evidenziata a livello epidemiologico fra morbo di Parkinson e del diabete mellito di tipo 2. Il meccanismo alla base di queste relazioni va probabilmente ricercato nelle notevoli somiglianze che esistono fra cellule beta del pancreas e neuroni dopaminergici. Le cellule beta, infatti, legano la dopamina e sono dotate per questo di un apparato molecolare completo. Diverse linee cellulari umane e di ratto presentano recettori dopaminergici (D1-D5) ed enzimi non solo per il suo catabolismo, ma anche per la sua produzione locale.
Lo scopo di questa tesi, dunque, è stato quello di approfondire i rapporti tra dopamina e beta cellule, con particolare riferimento alla regolazione della secrezione di insulina.
MATERIALI E METODI. Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando le cellule INS 832/13, che derivano dalla linea beta cellulare parentale INS-1, tramite transfezione stabile con un plasmide contenente il gene della proinsulina umana. La secrezione insulinica è stata valutata dopo stimolazione con glucosio (5,5 e 11 mM), IBMX (1mM) o KCl (30mM), in presenza ed assenza di dopamina 10 µM. La localizzazione del principale recettore dopaminergico (D2) è stata verificata al microscopio elettronico mediante tecnica di marcatura con immunogold. Tramite microscopia a fluorescenza, è stata valutata la co-localizzazione di insulina, dopamina e del recettore D2 nei granuli secretori delle cellule beta. È stato infine valutato l’effetto dell’inibizione del trasportatore V-MAT2 con la tetrabenazina, sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno e sui livelli cellulari di glutatione ridotto (GSH) ed ossidato (GSSG).
RISULTATI. I risultati ottenuti dimostrano che la dopamina inibisce significativamente la secrezione di insulina in presenza di concentrazioni stimolanti di glucosio (11 mM) da sola o insieme a IBMX o KCl, mentre non risulta invece modificata la secrezione basale. L’effetto inibitorio richiede la presenza della dopamina durante l’incubazione con i secretagoghi. La tecnica di immunogold dimostra che il recettore D2 è localizzato nei granuli di insulina, e che la sua concentrazione intragranulare diminuisce sotto stimolazione con glucosio. La co-localizzazione di insulina, dopamina e recettore D2 è stato confermata anche dalle tecniche di immunofluorescenza. E’ stato infine dimostrato che il blocco dell’ingresso della dopamina nei granuli secretori (ottenuto dall’inibizione di VMAT2 con la TBZ) causa un significativo aumento della produzione di ROS, e del rapporto GSSG/GSH dovuto soprattutto ad un aumento dei livelli di glutatione ossidato.
CONCLUSIONI. I risultati ottenuti dimostrano che la dopamina gioca un ruolo chiave nella regolazione della secrezione insulinica da parte delle cellule beta del pancreas. L’ effetto inibitorio esercitato dalla dopamina sulla secrezione insulinica è rivolto soprattutto nei confronti della stimolazione da parte del glucosio, mentre non è presente in condizioni basali. I risultati ottenuti indicano anche che l’effetto inibitorio della dopamina è probabilmente legato a complessi e precisi meccanismi di compartimentalizzazione intracellulare dei principali protagonisti del circuito regolatorio dell’insulina nelle cellule beta del pancreas.




ABSTRACT
INTRODUCTION. Dopamine is a neuromediator with important roles in various organs and systems. It carries out a crucial action in the nervous system, through the regulation of motor control pathways and cortical circuits involved in motivation, cognitive and reproductive functions, but also has various peripheral roles: it acts on circulation, physiology of the kidney, gastro-enteric system and pancreatic exocrine and endocrine physiology. In the relationship between endocrine pancreas and dopamine, beta cells are those on which dopamine has the greatest influence, although there are also interactions with other pancreatic cytotypes.
Recently, there has been an increasing interest in the scientific literature concerning the relationships between some antipsychotic drugs with anti-dopaminergic action and the risk of diabetes, as well as the epidemiological associations between the development of Parkinson's disease and type 2 diabetes mellitus. The mechanism underlying these relationships is probably to be found in the remarkable similarities between pancreatic beta cells and dopaminergic neurons. Beta cells bind dopamine and are therefore equipped with a complete molecular apparatus. Several human and rat cell lines have dopaminergic receptors (D1-D5) and enzymes not only for its catabolism, but also for its production on site.
The purpose of this thesis, therefore, was to investigate the relationship between dopamine and beta cells, with particular reference to the regulation of insulin secretion.
MATERIALS AND METHODS. The experiments were performed on INS 832/13 cells, a rat insulinoma beta cell line. They are derived from the parent cell line INS-1, via stable transfection with a plasmid containing the human proinsulin gene. Insulin secretion was evaluated after stimulation with glucose (5.5 and 11 mM), IBMX (1mM) or KCl (30mM), in the presence and absence of dopamine 10 µM. The localization of the main dopaminergic receptor (D2) was verified with immunogold labeling technique and observed under the electron microscope. The co-localization of insulin, dopamine and the D2 receptor was evaluated by fluorescence microscopy. Finally, the effect of the inhibition of the V-MAT2 transporter by the drug tetrabenazine (TBZ) on the production of reactive oxygen species (ROS) and on the levels of reduced and oxidized cellular glutathione was also evaluated.
RESULTS. Our results clearly show that dopamine significantly inhibits insulin secretion induced by stimulating 11 mM glucose, alone or in combination with IBMX or KCl, while basal secretion is not affected. The inhibitory effect requires the presence of dopamine during incubation in cell cultures.
The immunogold technique showed that the D2 receptor is localized in insulin granules, and that its intragranular concentration decreases under glucose stimulation. The co-localization of insulin, dopamine and D2 receptor was also confirmed by immunofluorescence techniques. Finally, we have shown that blocking the entry of dopamine into secretory granules (obtained by inhibiting VMAT2 with TBZ) causes a significant increase in ROS production, and in the GSSG / GSH ratio, mainly due to an increase in oxidized glutathione levels.
DISCUSSION. The obtained results show that dopamine plays a key role in the regulation of insulin secretion by the beta cells of the pancreas. The inhibitory effect exerted by dopamine mainly affects glucose-stimulated insulin secretion, while it is not present in basal conditions. Our results also indicate that the inhibitory effect of dopamine is probably linked to complex and precise mechanisms of intracellular compartmentalization of the main protagonists of the insulin regulatory circuit in the beta cells of the pancreas.