ETD

• A549
• chemoresistance
• hyperglycemia
• lung cancer
• NH1299

Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) rappresenta circa l'80-85% di tutti i tumori polmonari e costituisce una delle principali cause di mortalità oncologica nel mondo. Nonostante i progressi terapeutici degli ultimi decenni che comprendono chirurgia, radioterapia, chemioterapia, terapia molecolare mirata e immunoterapia; la chemioresistenza rimane uno degli ostacoli clinici più difficili da superare. La ricerca si è progressivamente orientata verso la comprensione di come il contesto biologico e metabolico della cellula tumorale influenzi la risposta ai farmaci, riconoscendo che cellule appartenenti allo stesso sottotipo tumorale possono comportarsi in modo radicalmente diverso a seconda del loro profilo molecolare.
Un aspetto importante riguarda lo stress ossidativo, infatti molti chemioterapici, tra cui le antracicline come la Daunorubicina, agiscono in parte attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). La capacità di una cellula di detossificare composti ossidativi è quindi direttamente rilevante per la sua resistenza o sensibilità a questi farmaci. Il 4-idrossinonenale (4-HNE), aldeide reattiva prodotta dalla perossidazione lipidica e considerata marker consolidato di danno ossidativo, è stata scelta come strumento per caratterizzare questa capacità nelle due linee prima di procedere con i trattamenti farmacologici. La detossificazione dell'HNE coinvolge diverse famiglie enzimatiche le aldo-cheto reduttasi (AKR), le aldeidi deidrogenasi (ALDH) e la carbonil reduttasi 1 (CBR1) la cui espressione differenziale tra le due linee potrebbe spiegare differenze nella risposta ai farmaci che agiscono per via redox, e potenzialmente identificare nuovi target molecolari da affiancare alle terapie convenzionali.
Un aspetto ancora poco esplorato riguarda il ruolo dell'iperglicemia cronica nella modulazione della chemioresistenza. La correlazione tra la patologia diabetica e maggiore suscettibilità allo sviluppo di tumori polmonari è documentata in letteratura, ma i meccanismi attraverso cui l'eccesso cronico di glucosio modifica la risposta ai chemioterapici restano in gran parte non chiariti. L'ipotesi di partenza del presente lavoro è che l'iperglicemia non agisca in modo uguale su tutti i modelli tumorali, ma che i suoi effetti dipendano in modo critico dal profilo metabolico, fenotipico e di detossificazione ossidativa della linea cellulare considerata. Dati preliminari ottenuti in uno studio precedente sulla linea A549 avevano già mostrato come l'iperglicemia cronica inducesse un aumento della produzione di lattato, una variazione dei marker epiteliali e mesenchimali e una modificazione della risposta ai chemioterapici.
Sul piano sperimentale, il lavoro è articolato in due fasi principali. La prima prevede una caratterizzazione comparativa delle linee NCI-H1299 e A549 in condizioni basali di normoglicemia. La caratterizzazione fenotipica è stata condotta mediante Western blot per i marker E-caderina, N-caderina e mediante Wound Healing assay per la valutazione quantitativa della capacità migratoria. La risposta allo stress ossidativo è stata valutata mediante saggio MTT dopo trattamento con concentrazioni crescenti di 4-HNE per 24 ore. Per identificare le basi enzimatiche delle eventuali differenze osservate, sono stati condotti western blot per AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10, AKR1C3, ALDH1A1 e CBR1, seguiti da saggi spettrofotometrici cinetici a 340 nm per misurare l'attività enzimatica specifica di alcune proteine su estratti grezzi cellulari, utilizzando substrati specifici (L-idoso per AKR1B1, HNE libero con i cofattori NADPH, NAD+ e NADP+ per le attività AKR/ALDH, GS-HNE con NADP+ per CBR1) con normalizzazione sul contenuto proteico determinato mediante metodo di Bradford. È stata inoltre caratterizzata la via dei polioli, composta da AKR1B1 e sorbitolo deidrogenasi (SDH), sia a livello proteico che funzionale, poiché questa via è nota per attivarsi in condizioni di eccesso di glucosio e per influenzare l'equilibrio redox cellulare attraverso il consumo di NADPH, rendendola un potenziale mediatore degli effetti dell'iperglicemia sulla chemioresistenza.
La seconda fase sperimentale ha previsto il mantenimento della linea NCI-H1299 per quattro settimane in condizioni iperglicemiche (25 mM glucosio, NH1299HG) e normoglicemiche (5,5 mM, NH1299LG), periodo scelto per consentire un adattamento metabolico stabile e riproducibile. Sono stati valutati: la proliferazione cellulare monitorata mediante saggio SRB a intervalli di 24 ore fino a 72 ore; eventuali variazioni fenotipiche mediante marker epitelio-mesenchimali e l’induzione della via dei polioli. Il metabolismo glicolitico è stato quantificato attraverso il dosaggio enzimatico del lattato extracellulare nel terreno di coltura, tramite normalizzazione sul contenuto proteico. Infine, la risposta ai chemioterapici è stata determinata mediante saggio MTT dopo 48 ore di trattamento con concentrazioni crescenti di Daunorubicina e Paclitaxel, con stima dell'IC50 tramite curva dose-risposta e confronto statistico tra le due condizioni glicemiche.