ETD

• algoritmo genetico
• design of Experiments
• HUVEC
• LIPUS
• machine learning
• ottimizzazione parametrica
• proliferazione cellulare
• small data
• Taguchi
• ultrasound

La stimolazione ad ultrasuoni pulsati a bassa intensità (LIPUS, Low-Intensity Pulsed Ultrasound) rappresenta una tecnologia biofisica con applicazioni crescenti in medicina rigenerativa e ingegneria dei tessuti, grazie alla sua capacità di indurre risposte biochimiche cellulari attraverso stimoli meccanici acustici non termici e non invasivi. Studi preclinici hanno documentato effetti positivi su proliferazione cellulare, differenziazione, migrazione e processi angiogenetici in diversi tipi cellulari, rendendo la LIPUS un candidato promettente per applicazioni terapeutiche nella rivascolarizzazione tissutale e nella rigenerazione di tessuti danneggiati.
Tuttavia, la traslazione clinica di questa tecnologia è oggi ostacolata da un limite metodologico critico: l'efficacia biologica della LIPUS dipende in modo complesso e non lineare dall'interazione di parametri fisici operativi, la frequenza di ripetizione degli impulsi (PRF), il ciclo di lavoro (DC), la durata di stimolazione, la frequenza e la pressione acustica, il cui spazio combinatorio supera le mille configurazioni possibili. La maggior parte degli studi disponibili in letteratura adotta un approccio empirico di tipo trial-and-error, esplorando un numero ristretto di combinazioni in modo non sistematico, senza garanzia di intercettare l'ottimo globale del sistema. Questo approccio è intrinsecamente inefficiente: ogni condizione sperimentale richiede cicli di coltura cellulare di diversi giorni, saggi biologici distruttivi, repliche indipendenti e strumentazione avanzata, rendendo uno screening puramente combinatorio non solo costoso ma di fatto impraticabile. Ne risulta una frammentazione della letteratura, con protocolli ottimali spesso specifici per singolo laboratorio e difficilmente generalizzabili o confrontabili tra studi.
L'ipotesi centrale di questo lavoro è che sia possibile sostituire lo screening empirico con un framework computazionale strutturato, capace di mappare l'intero spazio dei parametri LIPUS con un numero minimo di esperimenti biologici, identificando in silico le configurazioni ottimali prima di sottoporle a validazione sperimentale. A tale scopo, il framework è stato applicato alla massimizzazione della proliferazione di cellule endoteliali HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), modello cellulare di riferimento per i processi angiogenetici e la rivascolarizzazione tissutale, scelta motivata dal ruolo della proliferazione endoteliale come prerequisito biologico vincolante per l'attivazione dell'angiogenesi in vivo.
La pipeline metodologica sviluppata integra tre approcci sequenziali e complementari. Nella prima fase, la progettazione degli esperimenti è stata strutturata mediante la matrice ortogonale di Taguchi L16(4⁵), che permette di esplorare i cinque parametri LIPUS a quattro livelli ciascuno attraverso sole 16 prove sperimentali, rispetto alle 1024 combinazioni di un piano fattoriale completo. La scelta di questa struttura risponde a una precisa esigenza metodologica: la proprietà di ortogonalità garantisce la stima indipendente degli effetti principali di ciascun parametro, l'assenza di collinearità tra i fattori e la massima copertura informativa del dataset con il minimo numero di repliche biologiche. In questo senso, la matrice di Taguchi non è impiegata come semplice strumento di ottimizzazione statistica, ma come strategia di campionamento intelligente che fornisce agli algoritmi di Machine Learning un dataset ridotto ma massimamente esplorativo.
Nella seconda fase, i dati biologici raccolti sono stati utilizzati per addestrare e confrontare tre modelli surrogati di regressione supervisionata: la Regressione a Processi Gaussiani con determinazione automatica della rilevanza (GPR-ARD), la Rete Neurale Artificiale (ANN) e l'Albero di Decisione (CART). La scelta di operare in regime di small data, con sole 16 osservazioni reali, ha richiesto l'adozione di una fase preliminare di Data Augmentation basata su perturbazioni stocastiche accoppiate tra variabili di ingresso e target, e l'utilizzo della Leave-One-Out Cross-Validation come protocollo di validazione incrociata. I tre modelli sono stati selezionati per le loro proprietà matematiche complementari: la GPR-ARD per la sua capacità bayesiana di quantificare l'incertezza predittiva, proprietà critica in contesti a campionamento limitato; l'ANN come termine di confronto per documentare empiricamente i limiti delle architetture parametriche massive in regime di small data; il CART per la sua interpretabilità strutturale e per evidenziare l'instabilità dei modelli rule-based con pochi dati. Il confronto tra i modelli è stato formalizzato attraverso un sistema di ranking olistico normalizzato e validato statisticamente mediante test non parametrici di Friedman e Wilcoxon.
Nella terza fase, il modello surrogato selezionato è stato integrato come funzione di fitness all'interno di un Algoritmo Genetico personalizzato, progettato per esplorare stocasticamente lo spazio continuo dei cinque parametri e identificare le configurazioni che massimizzano la proliferazione cellulare attesa. Il GA incorpora un operatore di mutazione adattiva guidato dal vettore di importanza dei parametri estratto dal modello surrogato, che concentra la ricerca sulle variabili più influenti sulla risposta biologica. I protocolli ottimali identificati in silico sono stati infine sottoposti a validazione sperimentale in vitro su colture HUVEC, selezionando punti di controllo distribuiti lungo l'intero range di performance predette, con l'obiettivo di valutare la capacità predittiva e la generalizzabilità del framework lungo tutto lo spettro biologico investigato, e non solo nelle regioni di massima proliferazione attesa.
Il framework proposto è concepito come un processo iterativo: i dati sperimentali raccolti in ciascun ciclo di validazione vengono reintegrati nel dataset di addestramento, arricchendo progressivamente il modello surrogato e riducendo il rischio di estrapolazione nelle iterazioni successive. Questo approccio rappresenta un'alternativa metodologicamente rigorosa e sperimentalmente sostenibile agli screening empirici convenzionali, con potenziale di trasferibilità a sistemi biofisici multivariati e prospettive applicative nella progettazione di protocolli di stimolazione fisica personalizzati in ambito clinico.