Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Titolo
Strategie di ottimizzazione per l'utilizzo di Saccharomyces cerevisiae nella produzione di virus adeno associati
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Parole chiave
- AAV
- Adenovirus
- Geni Helper
- Lievito
- Packaging
- ssDNA
- Terapia genica
- VLPs
Data inizio appello
16/07/2018
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
16/07/2088
Riassunto (Italiano)
Il lavoro ha come obiettivo l'ottimizzazione dell'utilizzo di S.cerevisiae come cellula di packaging per produrre virus adeno associati (AAV). Infatti l'utilizzo del lievito permetterebbe uno scale up economico e semplice per la produzione di AAV ad alto titolo, condizione fondamentale per i trials clinici in terapia genica, in cui il virus viene utilizzato. Per questo è stata testata la produzione di virus like particles (VLPs) e la qualità del DNA a singolo filamento (ssDNA) incapsidato, confrontando due condizioni: una in cui il lievito veniva trasformato con il gene Rep68 codificante per le Replicasi 68 e 40 d AAV, e l'altra trasformandolo con il gene Rep78 codificane per le Replicasi 78 e 52 di AAV. In entrambi i casi i ceppi erano stati trasformati con il plasmide (pRep68+VP o pRep78+VP) contenente il gene Rep e i geni VP1, 2 e 3 codificanti per le 3 proteine capsidiche, e con un plasmide (pAAV-GFP-URA) con due geni marker fiancheggiati dalle ITR, segnale per la replicazione del ssDNA e per il suo incapsidamento. Inoltre uno scopo del lavoro, per aumentare l'efficienza di produzione di VLPs in lievito, era creare un sistema che permettesse di cotrasformare nel ceppo con pRep68/78+VP e pAAV-GFP-URA, i geni helper Adenovirali E1A, E1B, DBP, E4orf6, VA RNA, per valutare se la funzione di helper migliorasse la quantità e qualità della produzione virale. Parallelamente, è stata anche analizzata l'espressione dei geni Adenovirali in S. cerevisiae.
