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L’organo pineale nei vertebrati è un importante sito di produzione della melatonina, un ormone coinvolto nella regolazione di ritmi vitali come quelli circadiani e della riproduzione. In tutti i vertebrati la produzione di questo ormone è sottoposta al controllo di un orologio endogeno il quale, a sua volta, è regolato in parte dalle condizioni ambientali, essenzialmente dalla luce. Nei vertebrati superiori, in particolare nei mammiferi, la struttura che costituisce l’orologio endogeno principale e il luogo di produzione della melatonina sono separati; infatti l’orologio endogeno è situato nel nucleo suprachiasmatico e la melatonina è prodotta nell’organo pineale. Nei vertebrati inferiori, come ad esempio l’anfibio anuro Xenopus laevis, invece troviamo che l’organo pineale è la sede di entrambi: svolge direttamente la funzione di orologio endogeno e rappresenta il sito principale di produzione dell’ormone melatonina.
Esistono geni la cui trascrizione ha un andamento che corrisponde nettamente ad un ritmo giorno-notte. In particolare, dalla letteratura conosciamo geni espressi nell’organo pineale che codificano per enzimi della via di biosintesi della melatonina, come Aanat (Serotonina-N-acetil-transferasi) e Tph (Triptofano idrossilasi), la cui trascrizione ha un andamento ciclico con un’ espressione alta di notte e bassa di giorno. Inoltre sono stati individuati alcuni geni considerati fondamentali per l’orologio circadiano, tra cui i fattori di trascrizione Clock e B-mal; alcuni di questi geni hanno a loro volta un’espressione ritmica.
Nel mio lavoro di tesi ho studiato Brain Specific homeobox (Xbsx), un gene espresso specificamente nel territorio dell’organo pineale durante lo sviluppo di Xenopus laevis. Attualmente la funzione di questo gene non è nota, ma data la presenza della sequenza homeobox si può ipotizzare che codifichi per un fattore di trascrizione.
Informazioni cruciali per la determinazione del ruolo svolto da Xbsx possono essere ottenute da un’analisi dettagliata dell’espressione di questo gene.
In una prima serie di esperimenti ho voluto valutare se Xbsx fosse espresso in cellule in proliferazione o in differenziamento. Utilizzando l’analogo di base bromodeossiuridina (che viene incorporato dalle cellule in divisione) e confrontando la sua incorporazione con l’espressione di Xbsx a vari stadi (24, 32, 37 e 40) ho trovato che a stadio 24 Xbsx è espresso soprattutto in cellule differenziate con una piccola sovrapposizione con la zona in proliferazione, mentre a stadio 32 e negli stadi successivi è nettamente espresso soltanto in cellule differenziate.
Visto ciò, ho cercato di capire in quali tipi di cellule differenziate Xbsx fosse espresso. Nell’organo pineale ci sono essenzialmente due tipi di cellule: i fotorecettori e le cellule gangliari. Ho confrontato, mediante ibridazione in situ su sezione, l’espressione di Xbsx con quella di XOtx5, un gene espresso specificamente nei fotorecettori e con quella di Hermes, un marcatore di cellule gangliari. I dati ottenuti hanno dimostrato che Xbsx è espresso soltanto nei fotorecettori, avendo un’espressione completamente sovrapponibile a quella di XOtx5 e complementare ad Hermes.
Essendo un gene espresso specificamente nei fotorecettori, nei quali è prodotta la melatonina, ho poi cercato un possibile coinvolgimento di Xbsx nella regolazione dei ritmi circadiani. In particolare ho voluto accertare se la sua espressione fosse di tipo ritmico. A questo scopo ho confrontato la sua espressione con quelle di geni noti avere un’espressione circadiana in Xenopus laevis, come Aanat-2 e Tph. Ho quindi utilizzato un sistema di crescita degli embrioni in dodici ore di luce e dodici di buio alternate fino allo stadio 46. A questo stadio ho fissato gli embrioni ad orari prestabiliti (6:30, 12:30, 18:30, 00:30) e ne ho prelevato i cervelli. Sui cervelli ho effettuato ibridazioni in situ whole-mount, confrontando l’espressione di Xbsx con quelle di Aanat-2 e Tph. Questi esperimenti hanno dimostrato che i livelli di espressione di Xbsx sono analoghi a quelli di questi due geni, cioè di tipo ritmico, alti di notte e bassi di giorno.
Avendo studiato questi aspetti descrittivi, in futuro potrà essere utile procedere ad analisi di tipo funzionale, esaminando gli effetti della perdita e del guadagno di funzione di Xbsx. Uno dei metodi più efficaci per generare la perdita di funzione in Xenopus consiste nella microiniezione di oligonucleotidi antisenso. In particolare ho intenzione di utilizzare un morpholino di cui per ora ho saggiato la specificità. Il saggio di specificità consiste nell’utilizzare due costrutti recanti una parte della regione codificante per la proteina Myc riconosciuta da anticorpi commerciali. Un costrutto contiene, oltre a questa regione, la sequenza bersaglio esatta del morpholino mentre l’altro presenta una mutazione in questa sequenza. Ho quindi microiniettato questi costrutti in embrioni a stadio di 2 cellule ed ho effettuato un’analisi di western blotting per verificare la presenza delle proteine di fusione negli embrioni a stadio 10. Così ho potuto verificare che il nostro morpholino è effettivamente specifico: soltanto negli embrioni microiniettati con la sequenza bersaglio esatta è stata inibita la traduzione della proteina di fusione. Esperimenti futuri saranno volti a determinare se la perdita di funzione di Xbsx sia in grado di influenzare in qualche modo l’espressione di geni chiave dell’orologio circadiano come Clock, Bmal e Period e anche quella degli stessi Aanat-2 e Tph.