• D-glucosio; AR; NF-kB; COX2.

Il glucosio è la fonte di energia primaria delle cellule del nostro corpo. Tuttavia, alti livelli di glucosio nel sangue, 126 mg/dl (7.0 mmol/L) a digiuno o 200 mg/dl (11 mmol/L) postprandiale, sono deleteri per le cellule, in particolar modo per quelle in cui la regolazione dell’internalizzazione del glucosio è insulino indipendente. È noto che alti livelli di glucosio intracellulari portano ad un incremento del flusso di glucosio nella via dei polioli, alla formazione di elevate quantità di prodotti finali di glicazione avanzata (AGEs), all’attivazione della proteina chinasi C (PKC), e ad un aumento dell’attività mitocondriale. Tutto questo si traduce sia in un aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che in una diminuzione dei sistemi di difesa antiossidante, condizione questa anche nota come stress ossidativo. L’incremento delle specie reattive dell’ossigeno può determinare danno ossidativo e l’attivazione di fattori di trascrizione sensibili all’omeostasi redox, come, ad esempio, NF-κB. Questo fattore svolge un ruolo importante come mediatore del processo infiammatorio promuovendo l’aumento dei livelli di un grande numero di proteine quali, ad esempio, citochine proinfiammatorie (TNFα, IL1, IL8), molecole di adesione (VCAM-1, ICAM-1), ossido nitrico sintasi inducibile iNOS, ciclossigenasi inducibile (COX2). Tutto questo porta all’instaurarsi di una risposta infiammatoria persistente patologica.
L’obiettivo di questa tesi di laurea è stato lo studio dell’azione pro-infiammatoria, in una linea cellulare umana di cristallino, indotta da elevate concentrazioni di glucosio valutata come incremento dell’espressione della Ciclossigenasi 2 (COX2), mediante la tecnica del Western Blotting. L’azione pro-infiammatoria del glucosio è stata valutata in diverse condizioni sperimentali utilizzando differenti tipologie di terreno e concentrazioni di siero fetale bovino (FBS) al fine di definire la condizione di coltura ottimale che ci permettesse di visualizzare l’effetto pro-infiammatorio. Tale risposta, nelle condizioni sperimentali adottate, è stata osservata sia in termini di concentrazione di effettore sia valutando il tempo in cui si osserva la massima espressione della Ciclossigenasi 2 a seguito della stimolazione con glucosio. Dai risultati ottenuti è emerso che le condizioni sperimentali ottimali alla valutazione del processo infiammatorio prevedono un’iniziale incubazione delle cellule per 24 ore in terreno MEM, arricchito con lo 0,5% di FBS, l’1% di L-Glutammina e 50μg di gentamicina, cui segue la stimolazione con 20 mM e 45 mM di Glucosio e un ulteriore incubazione di 48 ore.
Dal momento che diversi dati in letteratura riportano come l’espressione di COX2 sia regolata da NF-κB, l’attivazione di questo fattore di trascrizione è stata valutata mediante saggio al luminometro utilizzando come modello una linea cellulare epiteliale umana trasfettata stabilmente. Il lavoro di tesi ha quindi previsto la trasfezione di una linea umana epiteliale di cristallino con un plasmide contenente la sequenza genica della luciferasi (gene reporter) sotto il controllo regolatorio di NF-κB. È stata quindi costruita una retta di taratura utilizzando uno standard commerciale della proteina luciferasi ed è stata verificata l’attivazione di NF-κB nel nostro sistema cellulare stimolando le cellule sia con TNFα, utilizzato come controllo positivo, che con diverse concentrazioni di glucosio.
Infine, poiché studi in letteratura riportano un possibile coinvolgimento dell’aldoso reduttasi nella risposta infiammatoria indotta da alti livelli di glucosio e da citochine pro-infiammatorie, è stata valutata l’azione del Sorbinil, un noto inibitore dell’enzima, sulla modulazione dell’espressione di COX2 e della luciferasi, in cellule stimolate rispettivamente con glucosio e con TNFα. I risultati ottenuti non mostrano alcun decremento significativo sia dell’espressione di COX2 che della luciferasi. Ciò potrebbe essere spiegato sia con una ridotta biodisponibilità dell’inibitore nelle condizioni sperimentali adottate, sia con un parziale coinvolgimento dell’enzima nella stimolazione della risposta infiammatoria.