• Melanoma
• Inflammasome
• Zebrafish
• Neutrophils

Inflammasomes are cytosolic molecular platforms involved in the clearance of intracellular infectious agents and in the response to sterile insults, e.g. from ischemia or toxins. The most studied and well-characterized inflammasome is NLRP3, which consists of three main subunits: NLRP3, ASC and Pro-caspase-1.
NLRP3 leads to the activation of Caspase-1, then capable to process inflammatory chemokines precursors pro-IL-1β and pro-IL-18 into active form and, in addition, it initiates a lytic host cell death called pyroptosis.
Indeed, activation of NLRP3 inflammasome is known to be accompanied by rapid formation of micrometer-sized compact perinuclear structure called ASC-speck.
Overactivation of the inflammasomes is associated with several diseases, including cancer. Namely, NLRP3 is activated in human melanoma, the most aggressive and deadliest form of skin cancer.
To deeply investigate the impact of the inflammasome in melanoma we use the teleost Zebrafish (Danio rerio), a valuable system model. Specifically, the availability of robust genetic, transgenetic, and chemical tools have made the zebrafish a powerful model for identifying novel disease genes, visualizing cancer initiation, interrogating tumor microenvironment interactions, and supporting the discovery of novel potential therapeutic agents for melanoma treatment.
The project was divided into two parts: in the first part, the transgenic zebrafish fishline Tg(asc:asc-EGFP) was used to study melanoma and its role in the inflammasome activation. Indeed, activation of NLRP3 inflammasome is known to be accompanied by rapid formation of micrometer-sized compact perinuclear structure called ASC-speck. For this reason, Asc protein can use as a hallmark for the inflammasome activation. In the second part of the project, the transgenic zebrafish fishline Tg(lyz:dsRED) was used to study inflammasome and its role in the melanoma invasion. This has allowed to the characterization of the role of melanoma invasion in the emergency hematopoiesis.
Taking advantage of zebrafish model, xenograft experiments were performed with the two transgenic fishlines, using two cell lines: MXL90 and MNEO control clone, derived from stable transfection of M14 melanoma line with bcl-xL expression vector and empty vector respectively. After cell microinjection in zebrafish embryos at 2dpf, the screening of larvae is carried out with a stereomicroscope.
Chemical treatments are included in the xenotransplant assay to study the impact of pharmacological inhibition of the inflammasome on melanoma invasion, for the two parts of the project, and of the neutrophil production, for only the second one.
FlaTox (Legionella pneumophila flagellin (FlaA) and the anthrax protective antigen (PA) channel), a toxin, was microinjected in the otic vesicle, in the yolk sac, and in the muscle of the knock-in line Tg(asc:asc-EGFP), to solve the first object of the work and to obtain a positive control of the inflammasome activation. In addition, Tg(asc:asc-EGFP) larvae were also bathed in the toxin.
At the end of the work, experiments demonstrated that the knock-in line was not generated correctly, reason why ASC-speck formation was not observed.
Experiments performed with Tg(lyz:dsRED) showed that MXL90 is slightly more invasive than MNEO control clone. In addition, the human melanoma cells MXL90 injection increase slightly the number of neutrophils in comparison to the control clone MNEO and BUFFER.

Gli inflammasomi sono piattaforme molecolari localizzate nel citoplasma, coinvolti nella clearance degli agenti infettivi e nella risposta contro sterili insulti, quali ischemia o tossine. Il più studiato e ben caratterizzato tra gli inflammasomi è l’inflammasoma NLRP3, il quale consiste di 3 grandi subunità: NLRP3, ASC e la Pro-caspasi-1.
L’inflammasoma NLRP3 porta all’attivazione della Caspasi-1, poi capace di processare i precursori delle chemochine infiammatorie pro-IL-1β e pro-IL-18 nella forma attiva e, indurre una tipo di morte cellulare noto come piroptosi.
L’attivazione dell’inflammasoma NLRP3, inoltre, è nota essere accompagnata da una rapida formazione di strutture perinuclari dal diametro di 1 µm definite Asc-specks.
Una over-espressione degli inflammasomi è associata a diverse patologie, incluso il cancro. Più nello specifico, NLRP3 è attivato nel melanoma umano, il più aggressivo e mortale tra i cancri della pelle.
Per studiare l’impatto dell’inflammasoma nel melanoma, abbiamo utilizzato Zebrafish (Danio rerio), un valido sistema modello per studiare patologie.
Il progetto è stato diviso in due parti: nella prima, è stata utilizzata una linea transgenica di zebrafish Tg(asc:asc-EGFP) per studiare il melanoma e il ruolo che in esso ha l’attivazione dell’inflammasoma. Inoltre, l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 comporta la formazione di Asc-speck: per questa ragione, l’attivazione della proteina Asc è utilizzata come hallmark per l’attivazione dell’inflammasoma. Nella seconda parte del progetto, è utilizzata la linea transgenica Tg(lyz:dsRED)nz50 al fine di studiare l’inflammasoma e il suo ruolo nell’invasione del melanoma. Questo ha portato a caratterizzare il ruolo delle metastasi nella produzione dei neutrofili.
Grazie ai vantaggi di zebrafish come organismo modello, con le due linee transgeniche sono stati messi in atto xenotrapianti, utilizzando due linee cellulari: MXL90 e MNEO, derivanti da stabili trasfezioni della linea di melanoma M14 con un vettore di espressione contenente bcl-xL e un vettore vuoto, rispettivamente. Dopo la microiniezione delle cellule negli embrioni di zebrafish a 2 giorni post-fertilizzazione, è stato effettuato lo screening delle larve con lo stereomicroscopio.
Nello xenotrapianto sono inclusi trattamenti chimici per studiare l’impatto dell’inibizione farmacologica dell’inflammasoma sull’invasività del melanoma, per entrambe le parti del progetto, e per vedere gli effetti dell’inibizione sulla produzione dei neutrofili, per la seconda parte.
FlaTox (Legionella pneimophila flagellin (FlaA) and the anthrax protective antigen (PA) channel) è una tossina che è stata microiniettata nella vescicola otica, nel sacco vitellino e nel muscolo degli embrioni della linea knock-in Tg(asc:asc-EGFP) per risolvere il primo obiettivo del progetto, al fine di ottenere un controllo positivo dell’attivazione dell’inflammasoma. Inoltre le larve sono state incubate con la tossina.
Alla fine del lavoro, gli esperimenti hanno dimostrato che la linea knock-in non è stata generata correttamente, ragione per cui non si è osservata in nessun caso la formazione di Asc-specks.
Gli esperimenti messi in atto con la linea Tg(lyz:dsRED)nz50 hanno mostrato che MXL90 è leggermente più invasiva della linea di controllo MNEO. In particolare, l’iniezione delle cellule di melanoma umano MXL90 causano un leggero aumento del numero di neutrofili, in comparazione alla microiniezione di MNEO o del BUFFER.