• cognitive impairment
• intermittent hypoxia
• microglia
• OSAS

La sindrome delle apnee ostruttive del sonno (OSAS) è una condizione patologica
appartenente alla categoria dei disturbi respiratori del sonno che colpisce
prevalentemente gli adulti. L’eziopatogenesi dell’OSAS può essere ricondotta a
patologie pregresse, quali l’obesità, ma età, sesso maschile, menopausa e disarmonie
cranio-facciali rappresentano un fattore di rischio.
Questa patologia è causata da un’ostruzione totale (apnea) o parziale (ipopnea) delle vie
aeree superiori e comporta oscillazioni della pressione parziale dell’ossigeno (pO2) nel
sangue arterioso, ipercapnia e risvegli frequenti nelle persone che ne sono affette. A
livello tissutale le oscillazioni della pO2 causano fenomeni di ipossia a Intermittenza
(IH), ossia di rapidi cicli di ipossia e riossigenazione che possono causare stress
ossidativo ed una sovrapproduzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in alcuni
tessuti, con conseguente infiammazione a livello periferico. Evidenze in letteratura
sostengono che l’infiammazione periferica può portare ad infiammazione a livello del
sistema nervoso centrale e che l’IH rappresenta un fattore di rischio per l’insorgenza di
declino cognitivo nei pazienti affetti da OSAS. I meccanismi alla base del legame tra
neuroinfiammazione, OSAS e declino cognitivo non sono ben chiari e necessitano di
ulteriori studi.
Studi su pazienti si limitano a indagare il fenomeno grazie a tecniche di imaging del
sistema nervoso centrale o alla somministrazione di test psicometrici; per questo studi
su modelli animali sono ancora molto utilizzati. In questo contesto lo sviluppo di un
modello in vitro che possa mimare l’IH su cellule può rappresentare un passo in avanti
nella comprensione dell’insorgenza delle conseguenze della patologia OSAS.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di mettere a punto un modello sperimentale in
vitro di Ipossia a intermittenza con lo scopo di utilizzarlo per poter studiare questo
fenomeno e caratterizzarlo dal punto di vista dei meccanismi molecolari. Il sistema è
costituito da quattro componenti collegate tra loro: bombole di gas (O2, N2, CO2), un
miscelatore, scatole di resina realizzate mediante stampante 3D dove poter introdurre
piastre Petri o multiwell per colture cellulari e un incubatore per colture cellulari. Le
cellule sono state seminate su apposite piastre Lumox, che presentano un fondo
semipermeabile che permette loro di essere sensibili in tempi brevi ai cambiamenti
repentini dei livelli di ossigeno.
Per validare il funzionamento del modello in vitro è stata utilizzata una linea cellulare di
microglia umana (C20) che è stata sottoposta a due diversi protocolli di Ipossia a
Intermittenza, che differiscono per il fatto che sono seguiti o meno da un periodo di
riossigenazione. Dopo i trattamenti è stata valutata la vitalità cellulare con conta con
colorante Trypan Blue e l’attività metabolica delle cellule con saggio MTS; inoltre per
valutare l’effettiva riuscita dei protocolli di Ipossia a Intermittenza sono stati
quantificati i livelli della proteina HIF-1 mediante kit ELISA e lo stato ipossico delle
cellule mediante l’utilizzo di un kit di detection di ipossia. Il kit è basato sulla
quantificazione della fluorescenza emessa da un anticorpo coniugato ad un fluoroforo
fluorescente (Alexa Fluor 488®) che è in grado di riconoscere degli addotti formati in
caso di ipossia dal composto EF5 con le macromolecole biologiche.
I risultati ottenuti hanno confermato che le cellule sottoposte a trattamenti di ipossia a
intermittenza rispetto a quelle tenute e in condizioni di normossia mantengono una
vitalità inalterata ma mostrano un accumulo maggiore di HIF-1α, un’attività metabolica
ridotta e un maggiore stato ipossico.
Questo lavoro rappresenta un primo passo verso la validazione di un modello in vitro
che mimi la condizione di ipossia intermittente a cui sono sottoposte le cellule di
microglia a causa dell’OSAS. Data la difficoltà di ottenere rapidi cambiamenti di
ossigeno nelle colture cellulari e avere modelli in vitro validi ed efficaci nel mimare
questa condizione il suo utilizzo può essere importante per comprendere i meccanismi
molecolari alla base dei danni provocati dall’IH e dall’OSAS, portando a una maggiore
conoscenza dei meccanismi alla base del legame tra neuro-infiammazione e declino
cognitivo.